小鼠浦肯野细胞

小鼠浦肯野细胞

运用胶原酶 IV 和 Dispase 联合消化法从C57BL/6小鼠浦肯野细胞神经组织中分离神经元前体细胞，经密度梯度离心纯化后接种于 PLL 包被的培养皿中，采用含 B-27 supplement、NGF（10 ng/mL）和 bFGF（5 ng/mL）的 Neurobasal 完全培养基培养；通过免疫荧光双标检测 β-III-tubulin/Map2 共表达，免疫细胞化学染色显示突触蛋白（Synaptophysin）阳性，并经钙成像实验检测神经元电生理活性。

产品名称：小鼠浦肯野细胞

英文名称： Mouse Purkinje cells

组织来源： 小脑组织

默认种属 ：昆明小鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的小鼠浦肯野细胞采用胰蛋白酶消化法结合神经元专用培养基、化学试剂抑制法筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠浦肯野细胞经Neph3免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 小鼠浦肯野细胞完全培养基(含脂质浓缩液、BSA、Monothioglycerol、Transferrin、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 神经元细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 不增殖；不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠浦肯野细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

复苏准备：浦肯野神经元细胞专用完全培养基、无菌 PBS，准备神经元温和消化液，试剂 37℃水浴回温，超净台紫外消毒 30min，准备多聚赖氨酸包被 T25 培养瓶、15mL 离心管、无菌耗材，检查冻存管无破损漏液。

冻存管水浴解冻：液氮取出冻存管，迅速放入 37℃水浴，持续轻晃 1‑2min，大部分冰晶融化，残留少量冰屑即可取出，75% 酒精擦拭管壁，移入超净工作台。

稀释低速离心：无菌打开冻存管，细胞悬液缓慢滴加到含有 4mL 预热浦肯野细胞完全培养基的离心管，轻柔吹打混匀，800r/min 低速离心 6min，降低转速保护脆弱神经元，弃冻存上清。

重悬接种铺瓶：离心结束弃上清，加入 2mL 浦肯野细胞完全培养基，极轻柔吹打重悬细胞沉淀，禁止剧烈吹打损伤细胞，悬液转移至多聚赖氨酸包被 T25 瓶，补加培养基，缓慢晃动培养瓶，细胞均匀分布。

恒温孵育贴壁：培养瓶平稳放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱，静置孵育 24h，全程严禁挪动晃动，浦肯野细胞贴壁能力弱，晃动极易造成细胞脱落死亡。

半量换液镜检：24h 后只吸出一半旧培养基，补入同等体积预热新鲜完全培养基，不使用 PBS 冲洗，防止冲掉贴壁细胞，放回培养箱，每日镜检观察细胞胞体与树突突起生长，排查污染。

传代处理：浦肯野属于高度分化原代神经元，一般不做多次传代；如需处理，使用神经元温和消化液短时间处理，立刻终止，低速离心收集细胞，接种至新包被培养瓶，全部操作力度轻柔。

1.实验全程需在生物安全柜中操作，避免空气中的微生物污染培养体系。

2.培养器皿需用0.2%明胶预包被30分钟，PBS洗涤后加入内皮细胞专用培养基方可接种。

3.内皮细胞增殖较快，培养5-7天即可达到融合，传代时注意控制胰酶消化时间不宜过长。

4.补充10ug/ml胰岛素、5ug/ml转铁蛋白和2nM三碘甲腺原氨酸(T3)。

5.换液前预先检查培养基pH和颜色，若培养基过早变黄提示需缩短换液间隔至24小时。