小鼠脐动脉平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的小鼠脐动脉平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠脐动脉平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠脐动脉平滑肌细胞完全培养基(基础培养基，含FBS、EGF、bFGF、Insulin、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠脐动脉平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

复苏准备：脐动脉平滑肌细胞完全培养基、无菌 PBS、0.25% 胰酶‑EDTA 消化液置于 37℃水浴回温，超净台紫外消毒 30min，备好 T25 培养瓶、15mL 离心管、无菌移液耗材，核对冻存管，确认无开裂渗漏。

冻存管水浴解冻：液氮罐取出冻存管，快速置于 37℃水浴，持续轻晃 1‑2min，大部分冰晶融化，残留少量冰屑即可取出，75% 酒精擦拭管壁，移入超净台。

稀释离心除冻存剂：无菌打开冻存管，细胞悬液缓慢滴加到含有 4mL 预热完全培养基的离心管，轻柔吹打混匀，1000r/min 离心 5min，沉降细胞，去除 DMSO 冻存上清。

重悬铺瓶接种：离心结束弃上清，加入 2mL 脐动脉平滑肌细胞完全培养基，轻柔吹打重悬细胞沉淀，打散细胞团，悬液转移至 T25 培养瓶，补加足量培养基，多角度轻晃培养瓶实现细胞均匀铺板。

恒温孵育贴壁：培养瓶平稳放置于 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱，静置孵育 24h，尽量不移动培养瓶，保障平滑肌细胞贴壁伸展。

换液镜检：24h 后取出，吸弃旧培养基，PBS 轻柔漂洗细胞层，清除悬浮死细胞碎片，更换预热新鲜完全培养基，放回培养箱，每日镜检梭形细胞形态，排查微生物污染。

传代操作：细胞汇合度 80‑85%，弃培养基，PBS 清洗细胞 2 次，加入胰酶消化液 37℃消化 2‑4min，镜下细胞回缩变圆，加入完全培养基终止消化，吹打收集细胞，离心，按适宜比例分瓶传代。