小鼠前列腺上皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠前列腺上皮细胞采用先中性蛋白酶消化、后胶原酶-胰蛋白酶联合消化并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠前列腺上皮细胞经PCK免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠前列腺上皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠前列腺上皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材量充足，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质，剪碎至1mm3大小

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化液，37度消化30-40分钟，期间振荡2-3次

消化完成后加入含20%胎牛血清的完全培养基终止消化，用移液器反复吹打分散

依次过70um、40um细胞滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

用完全培养基重悬细胞，计数并检测活力，调整细胞密度后进行接种

原代培养要点

调整细胞密度至5x10^4-1x10^5 cells/cm2接种于胶原包被培养皿，37度、5% CO2培养

上皮细胞贴壁较慢，通常需24-48小时方可观察到贴壁细胞，建议48小时首次换液

培养基每2-3天更换一次，使用含10% FBS的DMEM/F12完全培养基

细胞融合达80-90%时可进行传代，建议采用温和的胰蛋白酶-EDTA(0.05%)消化传代

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用多聚赖氨酸或胶原预包被培养皿表面，可显著提高贴壁效率

上皮细胞生长缓慢：培养基中添加0.1mM IBMX和5ug/mL胰岛素，可促进上皮细胞增殖

交叉污染：严格无菌操作，培养基中添加双抗(100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)

无菌实验体系准备：超净台紫外灭菌 30min，准备小鼠前列腺上皮细胞专用上皮完全培养基、无菌 PBS、上皮专用温和消化液、基质胶包被培养瓶、离心管；37℃水浴回温试剂，上皮细胞贴壁能力偏弱，培养容器建议提前基质胶包被，全部器具酒精消毒后进台。

冻存细胞复苏融化：液氮罐取出细胞冻存管，快速放置 37℃水浴来回晃动，1‑2min 融化冻存液；冻存管外壁酒精消毒移入超净台，细胞悬液转移至装有上皮细胞培养基的 15mL 离心管，轻柔混匀，降低 DMSO 毒性。

离心富集细胞沉淀：离心管配平，950r/min 离心 6min；离心完成，超净台小心吸除上清液体，上皮细胞沉淀松散，吸上清动作缓慢，防止把细胞一同吸走。

重悬计数接种包被培养瓶：加入预热上皮细胞专用培养基，轻柔吹打管底沉淀得到单细胞悬液；完成细胞计数，调整接种密度，将细胞悬液接种至预先基质胶包被完成的培养瓶内，均匀铺散细胞。

培养箱静置孵育贴壁：放置 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置孵育，前 24h 尽量避免挪动培养瓶，方便上皮细胞粘附，镜下观察多边形上皮形态贴壁生长。

换液去除悬浮杂质死细胞：孵育 24h，取出培养瓶显微镜观察贴壁状态，弃旧培养基，PBS 轻柔冲洗细胞层 1 次，不可大力冲刷，上皮细胞容易脱落；补入新鲜预热上皮完全培养基放回培养箱，每 2‑3 天更换培养基。

传代温和消化扩增：细胞汇合度 75%‑80% 进行传代，弃培养基，PBS 轻洗细胞层，使用上皮温和消化酶 37℃孵育；镜下细胞收缩、细胞间隙变大，立刻加入完全培养基终止消化；轻柔吹打收集细胞悬液，离心重悬，接种基质胶包被的新培养瓶，继续扩增开展后续实验。