小鼠全骨髓细胞

方法简介  实验室分离的小鼠全骨髓细胞细胞采用冲洗骨髓、红细胞裂解法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠全骨髓细胞，不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠全骨髓细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 悬浮

细胞形态： 圆形

传代比例： 不传代

传代特性： 不增殖；不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠全骨髓细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，采集血液或提取组织免疫细胞

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、RPIM-1640或DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

采集实验动物全血或获取组织悬液，用PBS稀释至适当体积

缓慢叠加于Ficoll密度梯度分离液上方，室温2000rpm离心20分钟

收集界面白色单个核细胞层，用PBS洗涤2次，300g离心8分钟

用含10%FBS的RPIM-1640完全培养基重悬细胞，计数并检测活力

可采用磁珠分选法进一步富集目标免疫细胞亚群(如CD11b+巨噬细胞、CD3+T细胞等)

原代培养要点

免疫细胞多为悬浮或弱贴壁生长，使用完全培养基RPIM-1640+10%FBS+1%双抗

37度、5% CO2培养，初始接种密度建议1x10^6 cells/mL

巨噬细胞培养可添加M-CSF(20ng/mL)促进增殖和维持表型

T细胞培养需添加IL-2(10ng/mL)和抗CD3/CD28抗体刺激增殖

常见问题优化

免疫细胞活力差：操作全程保持低温，避免反复离心和吹打

细胞凋亡：培养基中添加IL-4(20ng/mL)和IL-10(10ng/mL)可抑制巨噬细胞凋亡

纯度不够：采用MACS磁珠分选可获得纯度>95%的目标免疫细胞

无菌环境与试剂准备：超净工作台紫外照射灭菌 30min，准备骨髓细胞完全培养基、无菌 PBS、红细胞裂解液、无菌离心管、细胞筛；37℃水浴回温培养基，红细胞裂解液室温放置，小鼠全骨髓含有多种混合细胞，操作避免剧烈震荡，备好 70μm 无菌细胞筛过滤杂质。

冻存全骨髓细胞复苏融化：液氮取出冻存管，37℃水浴快速晃动，1‑2min 融化冻存液体；冻存管外壁酒精消毒移入超净台，细胞悬液转移至装有骨髓完全培养基的 15mL 离心管，轻柔颠倒混匀，稀释 DMSO。

离心处理与红细胞裂解：离心管配平，1000r/min 离心 5min；弃全部上清，加入预冷红细胞裂解液，轻柔吹打重悬沉淀，室温避光裂解 3‑5min 裂解红细胞；裂解结束立刻加入足量 PBS 终止裂解反应。

过滤、二次离心收集骨髓细胞：将细胞混合液通过 70μm 无菌细胞筛过滤，去除骨碎片、细胞团块；滤液收集至新离心管，配平，1000r/min 离心 5min，弃上清，获得纯化全骨髓细胞沉淀。

重悬计数接种培养：加入小鼠全骨髓细胞完全培养基，轻柔吹打沉淀制备细胞悬液；细胞计数，调整细胞接种密度，接种于细胞培养瓶或者培养板。

CO₂培养箱孵育培养：放置 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱孵育，全骨髓属于混合原代细胞体系，24h 后观察贴壁与悬浮两类细胞状态，悬浮主要为造血系细胞，贴壁为骨髓基质细胞。

换液及传代处理：培养 24‑48h 后，吸取上层悬浮旧培养液，PBS 轻洗，补入新鲜完全培养基；贴壁基质细胞汇合至 80% 进行胰酶消化传代；悬浮造血细胞定期半量换液，根据实验目的分别收集贴壁、悬浮细胞用于后续检测。