小鼠软骨细胞

方法简介  实验室分离的小鼠软骨细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠软骨细胞经Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠软骨细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每3-4天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠软骨细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取胫骨/股骨/关节软骨等组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标骨组织或软骨组织，仔细去除软组织包膜

骨组织：剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化60-90分钟

软骨组织：剪碎后直接用II型胶原酶37度振荡消化4-6小时

消化液经70um和40um滤网过滤，400g离心10分钟收集细胞

原代培养要点

成骨细胞：使用DMEM+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养，细胞呈多角形贴壁

软骨细胞：使用DMEM/F12+10%FBS+10ng/mL TGF-beta3培养基，可悬浮或三维培养

成骨细胞培养14-21天后可检测到ALP活性和矿化结节形成

软骨细胞传代后易去分化，建议采用低传代次数(2-3代)或三维球状培养维持表型

常见问题优化

骨细胞得率低：延长胶原酶消化时间至90分钟，或采用两次消化法

软骨细胞去分化：采用高浓度悬浮培养(1x10^5 cells/mL)维持软骨表型

成骨细胞污染：采用差速贴壁法或免疫磁珠分选提高成骨细胞纯度

无菌耗材试剂准备：超净工作台紫外消毒 30min，准备小鼠软骨细胞专用完全培养基、无菌 PBS、Ⅱ 型胶原酶消化液、0.25% 胰蛋白酶‑EDTA、无菌离心管；37℃水浴预热试剂，软骨细胞对机械损伤敏感，吹打动作务必轻柔，全部耗材酒精消毒移入操作台。

冻存软骨细胞复苏融化：液氮罐取出冻存管，37℃水浴快速晃动，1‑2min 融化冻存液；冻存管外壁酒精消毒移入超净台，细胞悬液转移至装有软骨细胞完全培养基的 15mL 离心管，轻柔颠倒混匀，降低 DMSO 毒性。

离心收集细胞沉淀：离心管配平，1000r/min 离心 5min；离心完成取出离心管，超净台内吸弃全部上层上清液，留存管底软骨细胞沉淀。

重悬计数接种培养瓶：加入预热软骨细胞完全培养基，轻柔缓慢吹打管底沉淀，制备单细胞悬液；细胞计数，调整接种密度，将细胞悬液接种于 T25 培养瓶，摇匀细胞分布。

培养箱恒温孵育贴壁：放置 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置孵育 24h，软骨细胞呈多边形，等待充分贴壁，尽量少移动培养容器。

定期换液去除杂质：24h 后显微镜观察贴壁情况，弃旧培养基，PBS 缓冲液轻柔冲洗细胞层 1‑2 次，去除悬浮死细胞碎片；加入新鲜预热软骨完全培养基放回培养箱，每 2‑3 天进行换液，避免细胞发生去分化。

传代消化扩增，控制传代次数：细胞汇合度 75%‑80% 执行传代；弃培养基，PBS 冲洗细胞层，加入胰酶消化液，37℃短时间消化；镜下细胞回缩变圆，加入完全培养基终止消化；轻柔吹打收集全部细胞悬液，离心重悬分瓶；软骨细胞容易去分化，严格控制传代代数，尽早用于成软骨诱导实验。