小鼠视网膜色素上皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠视网膜色素上皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠视网膜色素上皮细胞经PCK免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠视网膜色素上皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： Accutase消化液或0.25%胰蛋白酶

小鼠视网膜色素上皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材量充足，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质，剪碎至1mm3大小

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化液，37度消化30-40分钟，期间振荡2-3次

消化完成后加入含20%胎牛血清的完全培养基终止消化，用移液器反复吹打分散

依次过70um、40um细胞滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

用完全培养基重悬细胞，计数并检测活力，调整细胞密度后进行接种

原代培养要点

调整细胞密度至5x10^4-1x10^5 cells/cm2接种于胶原包被培养皿，37度、5% CO2培养

上皮细胞贴壁较慢，通常需24-48小时方可观察到贴壁细胞，建议48小时首次换液

培养基每2-3天更换一次，使用含10% FBS的DMEM/F12完全培养基

细胞融合达80-90%时可进行传代，建议采用温和的胰蛋白酶-EDTA(0.05%)消化传代

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用多聚赖氨酸或胶原预包被培养皿表面，可显著提高贴壁效率

上皮细胞生长缓慢：培养基中添加0.1mM IBMX和5ug/mL胰岛素，可促进上皮细胞增殖

交叉污染：严格无菌操作，培养基中添加双抗(100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)

细胞复苏：取出小鼠视网膜色素上皮细胞冻存管，37℃水浴快速摇晃融化冻存液，冻存液融化完毕，75% 酒精消毒管壁，移入超净工作台。

稀释冻存细胞悬液：冻存管内细胞悬液转移至装有预热 RPE 完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀，稀释冻存保护试剂。

离心富集细胞沉淀：离心管配平，1000r/min 离心 5min，离心结束，小心吸除全部上清液，避免吹散管底细胞沉淀。

重悬制备单细胞悬液：加入视网膜色素上皮细胞专用完全培养基，轻柔吹打沉淀，打散细胞团聚，制备分散的细胞悬液。

计数铺板接种：取样计数活细胞，按照实验所需密度接种培养板，十字晃动培养器皿，使细胞均匀铺于板底。

培养箱静置孵育：平稳放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置孵育 24‑48h，减少挪动培养板，保障细胞贴壁。

换液及形态观察：镜检观察上皮细胞及色素颗粒形态，弃旧培养基更换新鲜培养基；细胞汇合后，用于视网膜屏障、氧化损伤造模实验。