小鼠小肠平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的小鼠小肠平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠小肠平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠小肠平滑肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠小肠平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

组织取材分离肌层：小鼠安乐死后，无菌取出小肠，预冷 PBS 清洗，去除肠系膜脂肪，纵向剪开肠管，用无菌玻片轻轻刮除内侧全部黏膜层组织，保留完整小肠肌层组织。

组织漂洗修剪碎化：收集肌层组织，PBS 多次漂洗去除黏膜残留碎片，显微剪刀将肌层剪碎至 1 mm³ 大小组织块，尽量切碎，方便酶液渗透进入组织内部。

复合酶水浴消化：组织碎块移入含 Ⅱ 型胶原酶 + 弹性蛋白酶消化液，37℃水浴消化 40‑50 min，每 5min 颠倒混匀，待组织呈现絮状松散，停止消化，切勿消化过度。

终止消化筛网过滤：加入含胎牛血清的平滑肌完全培养基终止酶反应，反复吹打细胞悬液，70 μm 细胞筛过滤，除去未消化组织残渣，收集单细胞悬液。

离心洗涤去除杂质：1100 r/min 室温离心 7 min，弃上清废液，平滑肌完全培养基重悬细胞沉淀，再次离心洗涤一次，去除残留消化酶与细胞碎片。

细胞接种静置贴壁：调节细胞悬液浓度，接种普通细胞培养瓶，放入 37℃，5% CO₂培养箱培养，接种后 24 小时不要移动瓶子，帮助平滑肌细胞贴壁伸展。

换液纯化与传代操作：培养 24h 首次换液，清除悬浮杂细胞，每 2‑3 天更换培养基；细胞汇合至 80%‑85% 即可传代，传代消化控制胰酶作用时间，维持平滑肌细胞形态，抑制成纤维细胞污染。