小鼠嗅上皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠嗅上皮细胞采用胶原酶-胰蛋白酶联合消化法结合神经元专用培养基培养、化学试剂抑制法筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠嗅上皮细胞经β-Tubulin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠嗅上皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 属于高度分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠嗅上皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材量充足，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质，剪碎至1mm3大小

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化液，37度消化30-40分钟，期间振荡2-3次

消化完成后加入含20%胎牛血清的完全培养基终止消化，用移液器反复吹打分散

依次过70um、40um细胞滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

用完全培养基重悬细胞，计数并检测活力，调整细胞密度后进行接种

原代培养要点

调整细胞密度至5x10^4-1x10^5 cells/cm2接种于胶原包被培养皿，37度、5% CO2培养

上皮细胞贴壁较慢，通常需24-48小时方可观察到贴壁细胞，建议48小时首次换液

培养基每2-3天更换一次，使用含10% FBS的DMEM/F12完全培养基

细胞融合达80-90%时可进行传代，建议采用温和的胰蛋白酶-EDTA(0.05%)消化传代

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用多聚赖氨酸或胶原预包被培养皿表面，可显著提高贴壁效率

上皮细胞生长缓慢：培养基中添加0.1mM IBMX和5ug/mL胰岛素，可促进上皮细胞增殖

交叉污染：严格无菌操作，培养基中添加双抗(100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)

鼻腔嗅上皮组织取材：小鼠安乐死后，无菌剥离小鼠鼻腔颅骨，显微镜下精细剥离鼻腔顶部嗅上皮薄层组织，剔除鼻骨、呼吸上皮、软骨等无关组织，放入预冷 HBSS 缓冲液。

组织漂洗修剪碎化：HBSS 缓冲液反复漂洗嗅上皮组织，去除血液和鼻腔分泌物，显微剪刀把嗅上皮剪碎至 1 mm 以内组织碎块。

胶原酶‑胰酶联合消化：组织碎块转移至 Ⅰ 型胶原酶‑胰酶混合消化液，37℃水浴消化 25‑30 min，定时颠倒混匀，解离嗅上皮各类细胞。

终止消化筛网过滤：嗅上皮完全培养基终止酶消化，轻柔吹打悬液，70 μm 细胞筛过滤除去软骨、结缔组织残渣，收集细胞悬液。

离心洗涤去除杂质：1000 r/min 离心 7 min，弃上清废液，嗅上皮细胞完全培养基重悬沉淀，二次离心洗涤去除消化酶残留。

基质包被培养板接种：调整细胞悬液浓度，接种提前基质胶包被的培养板，置于 37℃、5% CO₂培养箱静置孵育，利于嗅上皮细胞贴壁。

定期换液纯化培养：24h 首次半量换液，去除悬浮死细胞碎片；每 2‑3 天更换培养基；原代嗅上皮细胞增殖能力弱，尽量早期开展实验，避免长期培养细胞分化凋亡。