小鼠胰岛β细胞

方法简介  实验室分离的小鼠胰岛β细胞采用先用胶原酶消化分离得到胰岛、再用胰酶逐级消化胰岛制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠胰岛β细胞经Insulin含量检测，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 小鼠胰岛β细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 不建议传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠胰岛β细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取胰腺/睾丸/肾上腺等内分泌腺体

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标内分泌腺体组织，仔细去除周围结缔组织

剪碎组织后采用胶原酶消化法(37度、45-60分钟)分散细胞

经滤网过滤后，采用密度梯度离心纯化目标细胞

胰岛细胞可采用Handy solution差速沉淀法进一步纯化

原代培养要点

胰岛beta细胞：使用CMRL-1640+10%FBS+10mM HEPES+50uM beta-巯基乙醇

睾丸间质细胞：使用DMEM/F12+10%FBS+0.1% BSA培养

肾上腺皮质细胞：使用DMEM/F12+5%FBS+0.1uM地塞米松培养

常见问题优化

胰岛细胞纯度不高：采用Handy solution梯度离心可获得纯度>90%的胰岛细胞

内分泌细胞功能维持：添加相应激素(如IGF-1、IGF-2)可维持细胞功能

细胞存活率低：培养基中添加抗坏血酸和转铁蛋白可提高存活率

小鼠腹腔注射麻醉后颈椎脱臼处死，75% 乙醇全身浸泡消毒，仰卧固定于无菌解剖板，逐层开腹暴露胰腺组织，小心分离胰腺周边脂肪、淋巴结与结缔组织，完整剥离胰腺，置于预冷无菌 PBS 中漂洗去除表面血液。

将胰腺转移至无菌培养皿，剪碎至 1‑2mm 组织碎块，加入预消化胶原酶 V 工作液，37℃水浴恒温振荡消化 15‑20min，期间间断轻晃，观察组织呈絮状松散状态，及时终止消化。

加入预冷完全培养基中和胶原酶消化反应，反复轻柔吹打组织悬液，先后经 100μm、40μm 无菌细胞筛过滤，去除未消化大块组织残渣，收集过滤后的细胞悬液。

将细胞悬液分装离心管，1000r/min 离心 5min，弃上层上清液，使用 PBS 重悬沉淀重复洗涤 2 次，去除消化酶残留、红细胞及组织碎片。

采用密度梯度离心法纯化胰岛 β 细胞，配置梯度分离液，将细胞悬液缓慢铺于分离液上层，梯度离心后吸取目标细胞层，PBS 洗涤去除分离介质。

用胰岛 β 细胞专用完全培养基重悬细胞沉淀，显微镜下细胞计数，调整细胞接种密度，接种于提前包被的细胞培养板 / 培养瓶，放置 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置培养。

接种后 24h 观察细胞贴壁与存活状态，更换新鲜完全培养基去除未贴壁死细胞与杂质；后续每 48h 更换培养基，密切观察细胞形态、聚集状态，细胞汇合度达到 70‑80% 及时开展传代或后续实验。