小鼠脂肪细胞

方法简介  实验室分离的小鼠脂肪细胞采用胶原酶-胰酶联合消化法获得前脂肪细胞，经成脂诱导培养基诱导培养制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠脂肪细胞经油红O定性检测阳性，成脂染色数占比>60%，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 小鼠脂肪细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形、圆形

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠脂肪细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取皮下脂肪或棕色脂肪组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS、IBMX、地塞米松、胰岛素

分离纯化步骤

取实验动物脂肪组织，剪碎后加入II型胶原酶(1mg/mL)37度振荡消化1-2小时

消化液经70um滤网过滤，100g离心10分钟收集沉渣(含前脂肪细胞和脂肪细胞)

去除上层脂肪层，将沉渣重悬于PBS中，再次离心纯化

沉淀细胞接种于培养皿中，贴壁细胞即为前脂肪细胞/脂肪间充质干细胞

原代培养要点

前脂肪细胞使用DMEM/F12+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养

细胞呈梭形贴壁生长，融合达80-90%时传代

诱导分化：换用分化培养基(DMEM+10%FBS+0.5mM IBMX+1uM地塞米松+10ug/mL胰岛素)诱导48-72小时后换维持培养基

脂肪细胞培养7-14天后可观察到明显脂滴积累，Oil Red O染色阳性

常见问题优化

前脂肪细胞得率低：延长胶原酶消化时间至2小时，适当提高酶浓度

分化效率低：确保诱导培养基中各组分新鲜配制，IBMX需现用现配

细胞老化：控制传代次数在5代以内，早期代次分化潜能更佳

小鼠处死消毒，解剖获取白色脂肪组织，预冷 PBS 冲洗，剔除血管、筋膜，尽量保持脂肪细胞完整，操作全程低温，避免脂肪细胞破裂脂滴释放。

将脂肪组织剪碎，加入 I 型胶原酶消化液，37℃温和振荡消化 30‑40min，消化至组织松散，加入培养基终止消化。

100μm 细胞筛过滤，除去结缔组织残渣，收集过滤后的细胞悬液，脂肪细胞会漂浮于上层。

低速离心 300r/min，3min，低转速保护成熟脂肪细胞，小心弃下层沉淀，保留上层漂浮脂肪细胞层，PBS 轻柔洗涤上层细胞 2 次。

采用漂浮培养方式，将脂肪细胞转移，去除基质血管组分杂细胞，尽量减少吹打，防止脂滴破裂细胞死亡。

成熟脂肪细胞专用培养基轻柔重悬漂浮脂肪细胞，分装至培养器皿，放置 37℃、5% CO₂培养箱静置培养。

成熟脂肪细胞贴壁能力弱，以悬浮漂浮状态为主，12‑24h 观察细胞完整性，半量更换培养基；该细胞体外存活时间短，需要短时间内完成功能检测实验。