小鼠终板软骨细胞

方法简介  实验室分离的小鼠终板软骨细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化并结合软骨细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠终板软骨细胞经Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠终板软骨细胞完全培养基(含FBS、EGF、Insulin、Transferrin、Selenium Solution、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每3-4天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠终板软骨细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取胫骨/股骨/关节软骨等组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标骨组织或软骨组织，仔细去除软组织包膜

骨组织：剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化60-90分钟

软骨组织：剪碎后直接用II型胶原酶37度振荡消化4-6小时

消化液经70um和40um滤网过滤，400g离心10分钟收集细胞

原代培养要点

成骨细胞：使用DMEM+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养，细胞呈多角形贴壁

软骨细胞：使用DMEM/F12+10%FBS+10ng/mL TGF-beta3培养基，可悬浮或三维培养

成骨细胞培养14-21天后可检测到ALP活性和矿化结节形成

软骨细胞传代后易去分化，建议采用低传代次数(2-3代)或三维球状培养维持表型

常见问题优化

骨细胞得率低：延长胶原酶消化时间至90分钟，或采用两次消化法

软骨细胞去分化：采用高浓度悬浮培养(1x10^5 cells/mL)维持软骨表型

成骨细胞污染：采用差速贴壁法或免疫磁珠分选提高成骨细胞纯度

实验前期准备工作：37℃水浴预热软骨细胞专用完全培养基，准备无菌离心管、T25 培养瓶、PBS 缓冲液、胰酶消化液，超净台紫外消毒，检查全部试剂有无污染；确认冻存细胞信息，终板软骨细胞对温度、环境敏感，提前调试细胞培养箱参数 37℃，5% CO₂。

冻存细胞水浴复苏：从液氮罐取出冻存管，快速投入 37℃水浴，匀速摇晃冻存管加速融化，控制融化时间 1‑1.5min，残留少量冰晶即可，取出后 75% 酒精擦拭管身，带入超净台，全程缩短室温暴露时长，降低软骨细胞凋亡概率。

稀释离心清除冻存保护剂：把细胞悬液缓慢滴入装有完全培养基的 15mL 离心管，轻柔颠倒混匀，900r/min 离心 6min，离心结束，小心倾倒弃除上清，冻存保护剂 DMSO 会损伤软骨细胞，务必尽量去除干净，不要扰动管底细胞沉淀。

制备单细胞悬液接种：加入终板软骨细胞完全培养基，轻柔吹打沉淀，吹打力度不可过大，防止软骨细胞膜破损，充分混匀得到单细胞悬液，计数后按照标准密度接种至培养瓶，十字摇匀，让细胞均匀分布瓶底。

恒温培养箱静置孵育：放入细胞培养箱静置孵育，48h 内不要移动培养瓶，终板软骨细胞贴壁速度较慢，需要充足时间完成贴壁伸展，减少晃动带来的细胞悬浮流失。

换液及形态监测：复苏 48h 后进行首次换液，吸弃旧培养基，PBS 轻柔漂洗一遍，加入预热新鲜培养基，去除悬浮死细胞；每 2‑3 天换液一次，显微镜观察细胞多边形、短梭形软骨细胞特征，警惕细胞发生去分化形态改变。

传代收获实验使用：细胞汇合至 75%‑80% 进行传代，弃培养基，PBS 洗涤，加入胰酶消化，镜下多数细胞收缩变圆，加入完全培养基终止消化，收集细胞离心重悬分瓶；该细胞建议控制传代次数，高代次细胞易丢失软骨细胞表型，尽量使用低代细胞开展实验。