小鼠椎间盘髓核细胞

方法简介  实验室分离的小鼠椎间盘髓核细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法并结合软骨细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠椎间盘髓核细胞经Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠椎间盘髓核细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每3-4天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠椎间盘髓核细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取目标组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、相应专用培养基组分

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷PBS冲洗去除血液和杂质

剪碎组织后采用胶原酶消化法(37度、1-2小时)分散细胞

过滤后300g离心8-10分钟收集细胞

根据细胞类型采用适当方法进一步纯化(密度梯度离心/免疫磁珠分选/差速贴壁)

原代培养要点

将纯化后的细胞接种于适当包被的培养皿中

使用含10%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，根据细胞生长特性调整培养条件

常见问题优化

细胞得率低：根据组织特性优化消化时间和酶浓度

细胞纯度不高：采用多种纯化方法联合使用提高纯度

细胞表型维持：控制传代次数，必要时采用特殊培养基或包被基质

复苏实验前期准备：37℃水浴预热髓核细胞专用完全培养基，准备无菌离心管、培养瓶、PBS 缓冲液、低浓度胰酶消化液，超净台紫外消毒，核对冻存细胞标签；髓核细胞增殖能力偏弱，检查全部试剂无微生物污染，确认培养箱运行正常。

冻存细胞水浴快速融化：取出液氮冻存管，投入 37℃水浴轻柔晃动，1‑1.5min 融化冻存液，留存少量冰晶即可，75% 酒精擦拭冻存管外壁，带入超净台，尽量缩短细胞室温暴露时长，降低细胞凋亡。

稀释离心去除冻存保护剂：将细胞悬液缓慢滴加到含有完全培养基的 15mL 离心管，轻柔混匀，900r/min 离心 6min，离心完毕，小心弃除上清，DMSO 对髓核细胞毒性较强，上清尽量去除干净，不触碰底部细胞沉淀。

温和重悬细胞接种铺瓶：加入髓核细胞完全培养基，轻柔低速吹打沉淀，禁止大力吹打损伤脆弱细胞，制备单细胞悬液，计数后按照推荐密度接种 T25 培养瓶，十字摇匀，使细胞均匀分布瓶底。

培养箱静置孵育贴壁：放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置孵育，48h 内不移动培养瓶，髓核细胞贴壁速度慢，需要充足时间完成贴壁伸展。

换液以及细胞状态监测：复苏 48h 后首次换液，吸弃旧培养基，PBS 轻柔漂洗，加入预热新鲜培养基，去除悬浮死亡细胞；每 2‑3 天换液，显微镜观察多边形髓核细胞形态，警惕细胞去分化，留意污染迹象。

传代消化收获细胞：细胞汇合 70‑75% 进行传代，弃培养基，PBS 清洗，胰酶温和消化，镜下细胞皱缩变圆，立刻完全培养基终止消化，收集细胞离心重悬分瓶；尽量使用低代次髓核细胞，高代细胞容易丢失髓核细胞生理表型。