人口腔粘膜成纤维细胞

人口腔粘膜成纤维细胞

基于密度梯度离心联合免疫磁珠分选技术从手术废弃组织腔粘膜组织中分离原代成纤维细胞，在含bFGF/EGF的专用培养基中培养扩增；利用免疫荧光双标技术结合流式细胞术对Fibronectin, PDGFRβ进行多参数检测，并通过细胞免疫荧光验证目标蛋白的表达与功能。

产品名称：人口腔粘膜成纤维细胞

英文名称： Human Oral Mucosal Fibroblasts

组织来源： 口腔组织

默认种属 ：人

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的人口腔粘膜成纤维细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人口腔粘膜成纤维细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 人口腔粘膜成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人口腔粘膜成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷PBS缓冲液、消化液（Ⅰ型胶原酶、Dispase II）、胰蛋白酶、K-SFM培养基 + EGF + BSA（37℃预热）、双抗溶液。

3. 人源组织样本（临床手术废弃组织），所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. 经伦理委员会批准获取，碘伏消毒术野，无菌操作取出口腔组织。

2. 浸入冰预冷PBS缓冲液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入Ⅰ型胶原酶+Dispase II混合消化液，37℃消化46min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用K-SFM培养基 + EGF + BSA重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-210000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2天换液一次，镜检观察多角形或铺路石样排列，贴壁生长，细胞间紧密连接及生长状态。

取材前动物需禁食12小时，手术切除法处死后立即取口腔黏膜组织，置于预冷的PBS中运输至实验室，从取材到开始消化处理不超过20分钟。

实验用培养皿应提前用0.01%聚鸟氨酸室温孵育2小时，PBS洗涤后风干，该预处理对腔粘膜成纤维的初始贴附具有决定性作用。

该细胞具有贴壁生长特性，培养过程中需维持培养基pH在7.2-7.4之间，每2天更换新鲜培养基，传代时采用0.25%胰蛋白酶消化。

培养基中必须含有DMEM/F12含10% FBS和1%青霉素-链霉素，其中重组生长因子需分装保存于-80°C避免反复冻融，每次使用新鲜稀释至工作浓度以保证实验可重复性。

换液操作需在生物安全柜中进行，使用预温的培养基缓慢加入培养孔/皿中，避免产生气泡和液流冲击导致细胞脱落或损伤。