抗TNF-α自身抗体ELISA试剂盒

抗TNF-α自身抗体ELISA试剂盒

试剂盒预先包被抗TNF-α自身抗体捕获抗体的微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤后，用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，在酸的作用下最终转化为黄色，颜色深浅与样本中anti-TNF-alpha autoantibody的含量呈正相关。

第一阶段：准备工作 (Pre-preparation)

试剂回温：从冰箱取出试剂盒，将所有试剂（包括浓缩洗涤液、标准品、样本等）在室温（20-25℃）下平衡至少 30分钟。

注意：如果浓缩洗涤液有结晶，需置于37℃水浴助溶并混匀。

标准品稀释：按照说明书要求，使用专用稀释液对标准品进行梯度稀释（通常做7-8个浓度点），现配现用。

样本处理：确保血清、血浆或细胞上清液澄清无沉淀（如有沉淀需再次离心）。

第二阶段：加样与孵育 

加样：

在酶标板的对应孔中，分别加入 100 μL（具体体积看说明书）稀释好的标准品和待测样本。

设置空白孔（只加稀释液）。

建议：每个样本做2-3个复孔，数据更可靠。

孵育：

盖上封板膜，放入 37℃ 恒温箱孵育 1-2小时（或按说明书要求，如室温2小时）。

原理：让样本中的抗原与板上的捕获抗体结合。

 第三阶段：洗板与检测抗体

洗板（关键步骤）：

弃去孔内液体，每孔加满洗涤液（约300-350 μL），静置浸泡 30-60秒 后甩干。

重复洗涤 3-5次。最后一次需在吸水纸上用力拍干，确保无残留液体。

加检测抗体：

每孔加入 100 μL 稀释好的检测抗体工作液（生物素化抗体）。

盖上封板膜，37℃ 孵育 1小时。

关键点 说明

洗板 洗板不彻底是背景值高（花板）的主要原因。务必浸泡并拍干。

防污染 加样时枪头不要混用，避免交叉污染导致假阳性。

气泡 加样和洗板时避免产生气泡，气泡会干扰酶标仪读数。

时间控制  加样和加终止液的动作要快，尽量控制整板操作时间差在5-10分钟内。