人小胶质细胞

方法简介  实验室分离的人小胶质细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人小胶质细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 人小胶质细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 不规则形

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人小胶质细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：患者手术标本（年龄20-65岁），经伦理委员会审批后获取，每例可分离0.6-2.2×10⁶个细胞，活力>87%

试剂：0.1%胰蛋白酶、Ⅰ型/Ⅳ型胶原酶混合液、DNase I、BSA、MEM/F12培养基

分离纯化步骤

组织取材后迅速放入预冷PBS中转运，无菌操作下剔除周围组织，剪碎后加入0.1%胰蛋白酶、Ⅰ型/Ⅳ型胶原酶混合液、DNase I、BSA于37℃消化30-60分钟

细胞悬液依次过100目、200目滤网去除未消化组织块，收集滤液后离心收集细胞

经Percoll不连续密度梯度离心（400g/400g，10分钟）分离纯化目标细胞层

原代培养要点

调整细胞浓度至3×10⁴，接种于胶原/纤维连接蛋白包被的培养皿中，37℃、5% CO₂培养

神经/胶质细胞培养需添加B27或N2等神经特异性补充剂以维持细胞存活和突起生长

常见问题优化

细胞活力差：严格控制消化时间，除消化步骤外全程冰上操作，使用新鲜配制试剂

细胞贴壁率低：使用合适包被基质（胶原/纤维连接蛋白/多聚赖氨酸），优化接种密度

目标细胞占比低：优化消化条件提高目标细胞得率，改进分离策略减少非目标细胞污染

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷PBS缓冲液、消化液（Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶）、DNA酶Ⅰ、RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME（37℃预热）、双抗溶液。

3. 人源组织样本（临床手术废弃组织），所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. 经伦理委员会批准获取，碘伏消毒术野，无菌操作取出脑组织。

2. 浸入冰预冷PBS缓冲液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入Ⅳ型胶原酶+胰蛋白酶混合消化液，37℃消化47min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过200μm细胞滤网，采用Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-220000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2天更换新鲜培养基，镜检观察悬浮或半贴壁生长，圆形或椭圆形，折光性强及生长状态。