大鼠牙周膜干细胞

方法简介  实验室分离的大鼠牙周膜干细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠牙周膜干细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 大鼠牙周膜干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传10代以上

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠牙周膜干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：6-8周龄雄性SD大鼠，体重190-230g，单只取材可得0.9-1.6×10⁶个目标细胞，活率>92%

试剂：胶原酶D、Dispase II、胰蛋白酶、FBS、RPMI-1640培养基

分离纯化步骤

取目标组织用无钙镁PBS洗涤3次，剔除脂肪和结缔组织后剪成小碎片，加入胶原酶D、Dispase II、胰蛋白酶、FBS消化60-120分钟

消化产物经100目滤网过滤，PBS洗涤1次，400g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞沉淀重悬于含10% FBS的培养基中，经Ficoll密度梯度离心（400g，10分钟）纯化目标细胞

原代培养要点

调整细胞密度至2×10⁴接种于预处理培养皿，37℃、5% CO₂培养箱培养

干细胞增殖较慢，接种后3-5天可见小集落形成，7-10天可达到传代密度

常见问题优化

纯度不达标：优化密度梯度离心条件，延长免疫磁珠孵育时间，增加洗涤步骤

细胞生长缓慢：检查血清批次质量，补充必要生长因子，确保CO₂浓度和温度稳定

细胞形态异常：检查培养基pH值和渗透压，避免过度传代导致细胞老化

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷D-Hanks液、消化液（胶原酶Ⅳ+胰蛋白酶）+透明质酸酶、α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗、双抗。

3. SPF级SD大鼠（200-250g），10%水合氯醛腹腔注射麻醉，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取牙。

2. 置于冰预冷D-Hanks液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的牙组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与胶原酶Ⅳ+胰蛋白酶+透明质酸酶混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化47min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，1次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用Percoll密度梯度离心富集干细胞，去除未消化组织块。

2. 用α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗调整细胞浓度至120000.0cells/mL，接种于预涂明胶的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及梭形或多角形，贴壁生长，核质比高，核仁明显。