小鼠气管成纤维细胞

小鼠气管成纤维细胞

实验选用BALB/c小鼠，取材后迅速转移至预冷的PBS缓冲液中，经胶原酶I/II联合消化获取原代成纤维细胞，接种后置于37°C、5% CO2培养箱中，采用DMEM/F12完全培养基维持培养，每3天换液一次；细胞鉴定采用ChIP-seq检测vimentin阳性表达率，免疫组化(IHC)定量Collagen I表达量，结合Western blot分析下游通路蛋白表达变化，并通过自噬流检测验证细胞生物学活性。

产品名称：小鼠气管成纤维细胞

英文名称： Mouse Tracheal Fibroblasts

组织来源： 气管组织

默认种属 ：小鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的小鼠气管成纤维细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠气管成纤维细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠气管成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠气管成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷PBS液、消化液（胶原酶Ⅳ、透明质酸酶）、胰蛋白酶、K-SFM培养基 + EGF + BSA（37℃预热）、双抗溶液。

3. SPF级C57BL/6小鼠（18-22g），戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. CO2吸入法处死，碘伏消毒术野，无菌操作取出成纤维细胞组织。

2. 浸入冰预冷PBS液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入胶原酶Ⅳ+透明质酸酶混合消化液，37℃消化49min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用K-SFM培养基 + EGF + BSA重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-240000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2天换液一次，镜检观察多角形或铺路石样排列，贴壁生长，细胞间紧密连接及生长状态。

动物取材须在无菌条件下进行，气管组织获取后迅速转入含抗生素的Hanks液中转运，组织离体时间超过1小时将严重影响气管成纤维的分离效率和活力。

培养器皿必须提前用0.1mg/ml胶原酶I包被过夜，未包被的培养板气管成纤维贴壁效率极低，影响后续实验结果。

该细胞具有贴壁生长特性，培养过程中需维持培养基pH在7.2-7.4之间，每2天更换新鲜培养基，传代时采用0.25%胰蛋白酶消化。

培养基配方中DMEM/F12含10% FBS和1%青霉素-链霉素为必需组分，添加顺序和方式需严格按照SOP操作，错误的添加顺序可能导致生长因子失活或沉淀形成。

培养过程中定期观察培养基pH变化(颜色由红变黄提示需换液)，换液频率根据细胞密度调整，高密度时每日换液一次，低密度时每2-3天换液。