兔淋巴结淋巴细胞

方法简介  实验室分离的兔淋巴结淋巴细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔淋巴结淋巴细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 兔淋巴结淋巴细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 悬浮

细胞形态： 圆形

传代比例： -

传代特性： 不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔淋巴结淋巴细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：2.5-3.5月龄白色家兔，体重2.2-2.8kg，每只可分离1.8-3.2×10⁶个目标细胞，活力>89%

试剂：弹性蛋白酶、胰蛋白酶、EDTA、无钙镁PBS、DMEM/F12完全培养基

分离纯化步骤

全血样本经密度梯度离心法分离单个核细胞，去除红细胞后收集目标细胞层

细胞悬液经200目滤网过滤去除组织碎片，400g离心10分钟收集细胞沉淀，PBS洗涤1次

利用CD45磁珠阳性选择策略特异性富集白细胞，纯度>90%

原代培养要点

调整细胞密度至5×10⁵ cells/mL接种，置于37℃、5% CO₂恒温培养箱中悬浮培养

细胞呈悬浮生长，圆形、折光性强，不贴壁，换液时采用半量换液法补充新鲜培养基

常见问题优化

细胞活力差：操作全程保持低温，使用新鲜配制试剂，离心力不宜过高

细胞贴壁率低：免疫细胞本为悬浮生长，注意使用低吸附培养器皿

细胞生长缓慢：检查血清批次质量，补充必要细胞因子，确保CO₂浓度和温度稳定

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷D-Hanks液、消化液（胶原酶Ⅳ、透明质酸酶、胰蛋白酶）、RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME、双抗。

3. 健康新西兰大白兔（2.0-2.5kg），3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 空气栓塞法处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取外周血组织。

2. 置于冰预冷D-Hanks液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的目标组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与胶原酶Ⅳ+透明质酸酶+胰蛋白酶混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化35min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，2次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经200μm滤网过滤，采用Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞，去除未消化组织块。

2. 用RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME调整细胞浓度至100000.0cells/mL，接种于预涂未涂层的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2天更换新鲜培养基，倒置显微镜下观察细胞贴壁及悬浮或半贴壁生长，圆形或椭圆形，折光性强。