兔肺小动脉内皮细胞

兔肺小动脉内皮细胞

实验选用新西兰大白兔，取材后迅速转移至预冷的PBS缓冲液中，经机械分离+酶消化联合获取原代内皮细胞，接种后置于37°C、5% CO2培养箱中，采用含10% FBS的DMEM维持培养，每3天换液一次；细胞鉴定采用CCK-8增殖实验检测PECAM-1阳性表达率，生物膜干涉技术(Biacore)定量eNOS表达量，结合蛋白质印迹分析下游通路蛋白表达变化，并通过表面增强拉曼散射(SERS)验证细胞生物学活性。

产品名称：兔肺小动脉内皮细胞

英文名称： Rabbit Pulmonary Arteriole Endothelial Cells

组织来源： 肺组织

默认种属 ：兔

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的兔肺小动脉内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔肺小动脉内皮细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 兔肺小动脉内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔肺小动脉内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术器械（剪刀、镊子、止血钳）及培养耗材经121℃高压灭菌20min；超净台紫外照射30min。

2. 配制冰预冷D-Hanks液、Ⅳ型胶原酶+透明质酸酶混合消化液、DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗、胎牛血清、双抗，全部冰浴预冷。

3. 健康新西兰大白兔（2.0-2.5kg），3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉处理。

二、取材与预处理

1. 空气栓塞法处死，体表酒精消毒，暴露目标组织器官。

2. 无菌条件下摘取肺组织，冰预冷D-Hanks液漂洗去除血液及杂质，去除周围结缔组织和脂肪。

3. 眼科剪将组织剪碎至1mm³小块，转入离心管。

三、细胞分离与消化

1. 剪碎组织加入Ⅳ型胶原酶消化液，37℃水浴消化27min，期间每隔5-10min振荡吹打。

2. 用含血清培养基终止反应，经200目筛网过滤获取单细胞悬液。

3. 4℃、200g离心10min，弃上清，PBS洗涤两次，重悬细胞沉淀。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤膜过滤，采用Percoll密度梯度离心纯化内皮细胞，去除大颗粒杂质。

2. 用DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗重悬细胞沉淀，调整接种密度后接种至胶原预包被的培养器皿。

3. 37℃、5% CO2培养，每2-3天换液一次，定期倒置显微镜观察鹅卵石样铺路石状排列，贴壁生长，细胞边界清晰及生长情况。

取材前动物需禁食12小时，空气栓塞法处死后立即取动脉血管组织，置于预冷的PBS中运输至实验室，从取材到开始消化处理不超过20分钟。

培养板需用1%明胶预包被1小时后PBS洗涤3次，晾干备用，未经处理的培养表面会导致小动脉内皮贴壁率低于30%。

该细胞为贴壁生长型，体外可传代10-15次，建议每2天换液一次，传代比例控制在1:2以内以维持细胞正常形态和功能。

培养基中必须含有GM299培养基含20% FBS、5ng/ml VEGF和10ng/ml FGF，其中重组生长因子需分装保存于-80°C避免反复冻融，每次使用新鲜稀释至工作浓度以保证实验可重复性。

换液时仅更换1/2至2/3体积的新鲜培养基，避免完全换液造成已贴壁细胞脱落，操作时吸管尖端距培养面至少1cm高处缓慢加入。