兔骨髓单个核细胞

方法简介  实验室分离的兔骨髓单个核细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔骨髓单个核细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 兔骨髓单个核细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 混合

细胞形态： 混合

传代比例： -

传代特性： 不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔骨髓单个核细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：2.5-3.5月龄白色家兔，体重2.2-2.8kg，每只可分离1.8-3.2×10⁶个目标细胞，活力>89%

试剂：胶原酶Type I、Dispase II、胰蛋白酶、Hanks平衡盐溶液、DMEM/F12完全培养基

分离纯化步骤

脾脏取出后置于预冷PBS中，用注射器针筒研磨过滤，300g离心10分钟收集细胞

细胞悬液经200目滤网过滤去除组织碎片，400g离心10分钟收集细胞沉淀，PBS洗涤1次

采用免疫磁珠分选技术（MACS）富集目标免疫细胞亚群，纯度可达90%以上

原代培养要点

细胞重悬于含相应细胞因子的完全培养基中，按适当密度接种于低吸附培养皿，37℃、5% CO₂培养

免疫细胞体外存活期有限，建议实验在取材后7-14天内完成，期间定期检测细胞活力

常见问题优化

细胞活化状态改变：缩短体外培养时间，避免过度刺激导致细胞表型改变

细胞活力差：操作全程保持低温，使用新鲜配制试剂，离心力不宜过高

细胞贴壁率低：免疫细胞本为悬浮生长，注意使用低吸附培养器皿

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷D-Hanks液、消化液（RICAM、淋巴细胞分离液、NH4Cl）、DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗、双抗。

3. 健康新西兰大白兔（2.0-2.5kg），3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 空气栓塞法处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取骨髓。

2. 置于冰预冷D-Hanks液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的骨髓组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与RICAM+淋巴细胞分离液+NH4Cl混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化47min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，2次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除未消化组织块。

2. 用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗调整细胞浓度至120000.0cells/mL，接种于预涂明胶的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2-3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及形态因细胞类型而异，贴壁或悬浮生长。