地塞米松对细胞因子刺激的人眼球后成纤维细胞的影响
地塞米松对宫颈癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用
曾建华1,钟 玲1,徐 波2 (1重庆医科大学附属第二医院妇产科,重庆400010;2深圳市妇女儿童医院妇产科,深圳518028)
摘 要:目的 探讨超生理剂量的地塞米松对宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法 5~6周龄雌性BALB/c裸鼠皮下接种传代培养的HeLa肿瘤细胞,肿瘤长大后(接种后16 d)每天腹腔内注射超生理剂量的地塞米松(62·5 mg·kg-1·d-1),连续10 d,测量肿瘤直径,计算肿瘤体积及抑瘤率;对肿瘤进行透射电镜观察、原位细胞凋亡检测(TUNEL)、血管内皮生长因子(VEGF)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测。结果 超生理剂量的地塞米松体内注射能抑制宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长,诱导肿瘤细胞凋亡;与对照组相比,治疗组肿瘤体积变小[(1. 472±0. 082) cm3vs(0·383±0. 038) cm3,P<0. 01],抑瘤率为73. 99%,凋亡小体数目增多[(413±87)个vs(160±101)个,P<0. 01)],VEGF灰度值降低[(172. 833±12·978)vs(177·067±6. 875),P<0. 01],TNF-α灰度值无差异[(172. 833±12. 978)vs(177. 067±6. 875),P>0. 05]。结论 超生理剂量的地塞米松体内用药能显著抑制肿瘤生长,与诱导凋亡及抑制VEGF
有关,而与TNF-α无关。
关键词:宫颈肿瘤;地塞米松;凋亡;血管内皮生长因子;肿瘤坏死因子
中图法分类号:R73-351;R977. 11;R737. 33 文献标识码:A
Dexamethasone inhibits cervical carcinoma cell xenografted tumors in nudem ice
ZENG Jian-hua1,ZHONG Ling1,XU Bo2(1Department ofObstetrics and Gynecology,The Second Affiliated Hospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing 400010;2Department ofObstetrics and Gynecology,ShenzhenWomen and Children’sHospital,Shenzhen518028,China)
Abstract:Objective To investigate the effects of over physiological dose of dexamethasone on cervicalcarcinoma cell xenografted tumors in nude mouse.Methods HeLa cells were inoculated subcutaneously inBALB/c femalemice aged 5-6weeks. verphysiologicaldose ofdexamethasone(62. 5mg·kg-1·d-1)wasinjected into the peritoneum from the 16th day after inoculation for10 d. Diameters of tumorweremeasured every two or three days.The volumes and the inhibition rates of tumorwere calculated. Apoptotic bodieswere observed by transmission electronmicroscopy and counted byTUNEL. VEGF andTNF-αwere detected by immunohistochemistry.Results In vivo,over physiological dose ofdexamethasone can repress the growth of tumorand induce cell apoptosis. Comparedwith the controlgroup,the tumor sizeswere significantly smaller(P<0.01)with 73. 99% inhibition rates,the numberofapoptotic bodieswere significantly increased(P<0. 01)andVEGFwere reduced(P<0. 01). Butno differencewas found between the two groups inTNF-α(P>0. 05).Conclusion Over physiological dose ofdexamethasone can repress cervical tumor growthin vivo. This actionmay be related to apoptosis andVEGF,buthave no relationshipwithTNF-α.
Key words:cervical carcinoma;dexamethasone;cell apoptosis;VEGF;TNF-α
糖皮质激素是由肾上腺皮质束状带分泌的类固醇类激素,有重要的生理学作用,主要影响糖和蛋白质代谢。超生理剂量糖皮质激素具有抗炎、抗毒、抗免疫、抗休克及抗水肿作用。地塞米松治疗血液系统恶性肿瘤取得了可喜成绩。体外研究已证明:地塞米松可诱1导人宫颈癌细胞株HeLa细胞凋亡[1],对卵巢癌3AO细胞、卵巢癌HO-8910细胞、乳腺癌MCF-7细胞有明显增殖抑制作用[2-4]。动物实验表明:地塞米松对小鼠进展期肺腺癌有抗肿瘤作用[5],大剂量地塞米松有加强顺铂抗小鼠埃利希氏腹水癌作用[6]。给小鼠肝癌细胞株H22肿瘤模型腹腔注射地塞米松,给药组的瘤重和最终瘤体积与对照组比较显著减小,显著抑制体内肝癌细胞株H22肿瘤的生长[7]。本实验通过裸鼠移植瘤模型进一步研究地塞米松对宫颈癌生长的影响及机制。
1 材料与方法
1. 1 药品、试剂及仪器
地塞米松磷酸钠注射液(批号2005080139),购于西南药业股份有限公司。原位细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL试剂盒,Cat. No. 11684817910)购于罗氏公司,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒、血管内皮生长因子(VEGF)试剂盒、SABC免疫组化试剂盒、S-P免疫组化试剂盒(批号51282108)及DAB显色剂(批号50781680)购于博士德生物工程有限公司。仪器为HI-TACHI-H-7500透射电子显微镜。
1. 2 实验细胞
人宫颈癌细胞株HeLa细胞,由重庆医科大学基础医学研究所细胞培养室惠赠。常规方法复苏、培养、传代、接种。
1. 3 实验动物
5~6周龄雌性BALB/c裸鼠12只,体质量(16. 5±1. 4)g。清洁级动物,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号: SCXK(京)2002-2003,由重庆医科大学实验动物中心代养。
1. 4 动物模型的建立及处理
每只裸鼠右腋下近背部皮下接种HeLa细胞0. 3 ml(1×108/ml)。从接种第4天成瘤后开始用游标卡尺测量肿瘤直径,每2~3天1次,计算肿瘤体积。肿瘤体积(V)=长×宽2/2。用药前采用随机数字表法分为A、B两组,每组6只。A组:为对照组,每天腹腔内注入0. 4 ml生理盐水; B组:地塞米松剂量为每只每天1 mg(62. 5 mg·kg-1·d-1),从接种后第16天开始经腹腔内注入0. 4 ml地塞米松溶液,每天1次,连用10 d,停药后24 h处死,采集肿瘤标本。
1. 5 计算抑瘤率
抑瘤率(% )=(1?VT/VC)×100%,VT为用药组平均体
积,VC为对照组平均体积。
1. 6 标本处理
肿瘤标本经3. 5%戊二醛固定送电镜观察,经10%多聚甲醛固定送HE染色及TUNEL、VEGF及TNF-α免疫组化检查。以不加TUNEL、VEGF及TNF-α试剂为阴性对照。
1. 6. 1 TUNEL 每例标本于凋亡小体阳性较多处照相5张,经北航医学图像处理系统(4. 0版)处理后,以平均的凋亡小体数目作为一个标本的统计量。
1. 6. 2 TNF-α 采用SABC法, DAB显色。每张切片分别从上、下、左、右及中间观察5个不连续的高倍视野(×400),经北航医学病理图像处理系统处理后平均灰度值作为一个标本的统计量。
1. 6. 3 VEGF 采用S-P法, DAB显色。每张切片分别从上、下、左、右及中间观察5个不连续的高倍视野(×400),经北航医学病理图像处理系统(4. 0版)处理后平均灰度值作为一个标本的统计量。
1. 7 统计学分析
采用SPSS 10. 0统计软件进行小样本均数t检验
2 结果
2. 1 一般情况
全部裸鼠都有肿瘤生长,成瘤率100%。肿瘤标本经HE染色检查均有肿瘤生长。
2. 2 肿瘤体积
接种约3 d后肿瘤逐渐增大,用药后肿瘤的生长速度较对照组变慢,体积也较小,两组比较有显著性差异[t=29. 455,P<0. 01; (1. 472±0. 082) cm3vs(0. 383±0. 038) cm3]。以A组为对照,B组的肿瘤抑瘤率为73. 99%。
2. 3 电镜下凋亡小体观察
A组无早期凋亡表现,亦无凋亡小体形成(图1A);而B组则有较多凋亡小体形成(图1B),形态上有明显差异。
A:A组;B:B组
图1 肿瘤组织电镜图
2.4 TUNEL检测凋亡小体数目结果
肿瘤组织行TUNEL检测均有凋亡小体存在(图2)。A组数目少,而B组凋亡小体数目较多,两组比较有显著性差异[t=4.631,P<0.01;(413±87)个vs(160±101)个]。
2.5 VEGF灰度值
用药后VEGF的平均灰度值降低(图3),与A组比较有显著性差异[t=3.780,P<0.01; (174.883±11.565)vs(198.517±10.038)]。
2.6 TNF-α灰度值
B组与A组的平均灰度值比较无差异性(图4)[t=0·706,P>0.05; (172.833±12.978)vs(177.067±6.875)]。
3 讨论
3.1 地塞米松抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长 近几年来,肿瘤化疗取得了相当的进步,特别是对白血病、恶性淋巴瘤等的治疗有了突破,肿瘤患者生存时间明显延长,但对危害人类生命健康最严重的、占恶性肿瘤90%以上的实体瘤的治疗未能达到满意的效果。因此,如何提高对实体瘤的疗效是医务工作者应解决的迫切任务。本实验研究了地塞米松对宫颈癌实体瘤的影响,研究显示,超生理剂量地塞米松作用于裸鼠宫颈癌移植瘤,其肿瘤体积显著小于对照组,肿瘤抑瘤率为73.99%,表明地塞米松显著抑制裸鼠宫颈癌移植瘤的生长(P<0.01),与Zhang等[8]认为的地塞米松对实体瘤治疗无效的结论并不一致,这可能与地塞米松剂量有关,生理剂量无抗肿瘤作用,超生理剂量地
塞米松才有抗肿瘤作用。
3.2 地塞米松抑制宫颈肿瘤生长的可能机制
药物对肿瘤的抑制作用包括多个方面。诱导肿瘤1281细胞凋亡、抑制肿瘤组织新生血管生成是抑制肿瘤生长的主要机制[9,10]。资料显示,糖皮质激素诱导的细胞凋亡是受体依赖性的[11]。糖皮质激素通过简单扩散与细胞质内的激素-受体复合物结合,由细胞质向细胞核内移位,是外界刺激信息传递至细胞核、转化成细胞效应的信号通路的关键组成,参与细胞生长、增殖、转化及胚胎发育和肿瘤形成。超生理剂量的地塞米松与糖皮质激素反应要素的DNA受体位点结合后,受体的构象发生改变,激素-受体复合物与激素反应元件结合,诱导或抑制糖皮质激素反应性基因的转录,使细胞停止于G1期[12],最终使细胞发生凋亡,从而抑制肿瘤生长。本研究显示,宫颈肿瘤经地塞米松治疗后,肿瘤组织HE染色及透射电镜检查无明显组织细胞变性坏死,在电镜观察及TUNEL检测主要存在凋亡小体,并且凋亡小体形态及数目与对照组有明显差异,表明地
塞米松抑制宫颈肿瘤生长的机制之一可能通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用。
肿瘤血管的形成是肿瘤生长和转移的基础,原发肿瘤的生长和转移依赖于新生血管生成[10]。VEGF亦称血管渗透因子,阳性标记位于胞质中,是最重要也是最具有代表性的血管生长因子,是一种对血管生长有强诱导作用且是目前所知的唯一特异性作用于血管内皮细胞的一种生长因子,它的生物学特性与实性肿瘤的生长密切相关,VEGF的高表达可刺激肿瘤血管的形成,与血管生成和肿瘤生长相辅相成、相互依赖,导致肿瘤血管无限制地扩增,使肿瘤细胞无节制地生长,促进恶性肿瘤细胞的转移[13]。抑制VEGF的生成则可抑制肿瘤的生长及转移。有资料表明,地塞米松抑制小鼠肝癌细胞系H22肿瘤组织VEGF-mRNA的表达及微血管生成[14]。使用VEGF抗体抑制肿瘤血管生成,
抑制肿瘤细胞的生长,现已成为研究肿瘤治疗中的热点之一。本研究显示,宫颈肿瘤经超生理剂量地塞米松治疗后,VEGF的平均灰度值较对照组显著降低(P<0.01),表明地塞米松抑制宫颈肿瘤生长的另一机制可能是通过抑制VEGF的表达,从而抑制新生血管的
生成,与翟羽等报道的地塞米松抑制肝癌细胞株H22肿瘤生长和抗血管生成有关基本一致。
本研究还探索了地塞米松对宫颈癌TNF-α的影响。TNF-α是目前已知具有多功能性的细胞因子之一,具有广泛的生物学特性,对肿瘤有双重生物学效应。本研究显示,宫颈肿瘤经地塞米松治疗后,用药组与对照组的TNF-α平均灰度值比较无升高及降低(P>0.05),表明地塞米松抑制宫颈癌生长与TNF-α无关。这可能与TNF-α对肿瘤的双重生物学效应有关,既有抗肿瘤作用,又可促进肿瘤生长或转移[15]。
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