重组胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒

重组羧肽酶B酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书

（96T）           

1.试剂盒用途

该试剂盒用于体外定量检测大肠菌液体中重组羧肽酶B含量。本试剂盒仅供研究或工业生产使用。

2.试剂盒基本参数

灵敏度 = 1 ng/ml

检测范围：0.25 - 64 ng/ml

特异性：可检测重组羧肽酶B，与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。

重复性：板内，板间变异系数均 < 10%。

工作时间：熟练实验人员可在2.5小时内完成一次测定。

有效期：6个月

3.试剂盒组成及保存

未拆封的试剂盒可在2-8℃保存一周。

说明:

1、所有试剂瓶须旋紧瓶盖以防止蒸发和微生物污染。

2、酶标板-20℃可存放6个月，2-8℃存放勿超过一周。

4.试验所需自备物品

1. 酶标仪（滤光片波长450 nm和650nm）

2. 高精度移液器，EP管及一次性吸头，加样槽

3. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水

4. 洁净无纸屑的吸水纸或干布

5.待测样品注意事项

1、样品收集后若在1周内进行检测的可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或 -80℃（3个月内检测），避免反复冻融。

2、试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围，如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释后再测。

3、若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。

6.检测前准备工作

①请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒平衡至室温，观察溶液是否有结晶，如果有结晶按提示进行操作。提前15分钟打开酶标仪预热。

②稀释液配制

将浓缩标准品&样品稀释液 或 浓缩HRP-抗体稀释液用双蒸水稀释（1：10）。

③洗涤液配制

将浓缩洗涤液-1 或 浓缩洗涤液-2用双蒸水稀释（1：25）。

提示：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液温度应为室温）。请当日使用。

④标准品配制

将标准品于1000转/分离心1分钟后，加入标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟后上下颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为32ng/ml）, 然后进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度：32、 16、 8、 4、 2、 1、0.5 、0ng/ml。标准品&样品稀释液直接作为空白孔0 ng/mL。

提示：溶解和稀释标准品过程中尽量避免产生气泡。

倍比稀释方法 

取7只EP管，每管加入500 μL标准品&样品稀释液，从32 ng/ml的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL标准品&样品稀释液的EP管中混匀配成16 ng/ml的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。

提示：最后一管直接作为空白孔，不再加入标准品工作液。

⑤HRP-抗体工作液配制

实验前请先将抗体管1000转/分离心1分钟，以避免管壁及管盖上残留抗体。实验前计算实验所需用量（以100 μL /孔计算），实际配制时应多配制100-200 μL工作液。使用前15分钟，用HRP-抗体稀释液将浓缩辣根过氧化物酶化抗体稀释为工作浓度（抗体：稀释液 = 1：125），当日使用。

⑥显色底物（TMB）工作液配制

计算实验所需显色底物用量（以100 μL /孔计算），实际配制时应多配制100-200 μL显色底物工作液。使用前15分钟，用底物稀释液将TMB显色底物稀释为工作浓度（底物：稀释液 =1：20），避光保存，当日使用。

提示：配制显色底物（TMB）工作液要严格避免污染，如出现变蓝的现象应重新配制。

7.洗板方法

①自动洗板机：每孔加入洗涤液350-400 μL（根据加满孔的标准进行调整），注入和吸出间隔60秒。

②手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干，每孔加入洗涤液350-400 μL（根据加满孔的标准进行调整），浸泡2-3分钟，甩尽孔内液体，在洁净无纸屑的吸水纸上拍干。

8.操作步骤

①将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔（复孔），每孔100 μL。待测样品加入到其他孔，每孔100 μL，若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于37℃孵育60分钟。

提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动酶标板混匀避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。

②洗涤：甩尽孔内液体，在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干。每孔加入350-400 μL（根据加满孔的标准进行调整）洗涤液-1，浸泡2-3分钟，甩尽孔内液体，在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干。重复此洗板步骤3次。

③每孔加入HRP-抗体工作液100 μL，轻轻晃动酶标板混匀避免产生气泡，将酶标板覆膜并置于37℃孵育30分钟。    

④洗涤：用洗涤液-1洗板3次，方法同步骤2。

⑤洗涤：用洗涤液-2洗板2次，方法同步骤2。

提示：酶标板洗涤不完全可能会造成标准曲线梯度差，或背景值高。应注意加入洗涤液的体积，以加满酶标板的孔为标准进行调整，确保所有的孔浸泡在洗涤液中并浸泡2-3分钟。

⑥显色：每孔加显色底物（TMB）工作液100 μL，酶标板覆膜置于37℃ 孵育10分钟。

提示: 加显色底物推荐使用排枪和加样槽，但应严格避免底物污染，确保所使用的加样槽洁净或一次性使用，加液时移液枪的枪头切不要接触孔内溶液以避免污染，影响实验结果。可通过观察加样槽中底物是否变蓝预判底物是否被污染。根据实际显色情况酌情缩短或延长，显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。

⑦终止：每孔加终止液50 μL，终止反应，室温放置1分钟。推荐使用排枪和加样槽。

提示: