microRNA荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green荧光染料)采用特异性的上下游引物对反转录所得microRNA的cDNA产物进行定量检测。不同于其它公司的单条特异性引物扩增方法,Biorab采用双向特异性扩增引物(原理如图1),从而极大提高了miRNA的检测特异性,其可以区分极高相似度的miRNA分子、减少非特异性扩增(图2,3所示)。该miRNA荧光定量PCR试剂盒对可以对任何miRNA分子进行检测。miRNA荧光定量PCR试剂盒共有一万余种,试剂盒编号为MTAXXXXX,每一个miRNA分子对应一个检测试剂盒,可下载SYBR Green miRNA qPCR kit列表查询。如果您研究的miRNA分子不在我们的列表中,请来信咨询,我们将及时给您优化设计。该试剂盒中的每一对引物均经过设计优化,确保扩增效率和特异性。
产品组成:
2×Hi SYBR Green qPCR Mix
1ml
50×ROX Reference Dye
200μl
microRNA Primer F(10μM)
100μl
microRNA Primer R(10μM)
100μl
储存:请置于-20℃,可保存2年;避免反复冻融。
操作方法:
1.按以下组分配制反转录反应液(反转录反应需购买我司的一步法microRNA反转录试剂盒):
4×One step miRNA RT Solution
5μl
Rnase-Free H2O
Up to 20μl
2.在PCR 仪上按以下条件进行反应:
37℃——————60min
95℃——————5分钟
3.获得 cDNA 产物后使用microRNA 荧光定量 PCR 试剂盒进行 miRNA 定量检测。根据机型选择步骤A或B配制反应体系:
步骤A:需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR 仪,包括:ABI PRISM 7900HT、7300、7500 Real-TimePCR(Applied Biosystems);Mx3000P(Stratagene)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系:
2×Hi SYBR Green qPCR Mix
10μl
1×
50×ROX Reference Dye
0.4μl
1×
miRNA Primer F(10μM)
0.4μl
miRNA Primer R(10μM)
0.4μl
注:引物初次使用请用0.4μl,视实验结果进行调整。
步骤B:无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的RealTime PCR 仪,包括:LightCycler(Roche Diagnostics);MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-TimePCR(Bio-Rad & MJ);Line-Gene(Bioer,杭州博日)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系:
2×Hi SYBR Green qPCR Mix
10μl
1×
miRNA Primer F(10μM)
0.4μl
miRNA Primer R(10μM)
0.4μl
注:引物初次使用请用0.4μl,视实验结果进行调整。
4.进行 Real-Time PCR 反应,通常采用两步法,程序如下:
注意:使用该方法通常可以准确检测到>0.01fM的microRNA 分子,过多的循环数会造成精确性降低。推荐的循环数为 30 个,在检测极低样品浓度时可将循环数调整到 35 个。
5.扩增结果分析和数据处理:
反应结束后确认 Real-Time PCR的cDNA 样品和 NTC 阴性对照的扩增曲线和融解曲线。
6.标准品的使用
该试剂盒配备的标准品为单链 DNA 分子,其与目标microRNA 分子反转录产物完全相同,因此可直接用于 PCR扩增,从而检测 PCR 体系的可靠性。其浓度为 1pM,通常20μl PCR 体系中加入1μl,可获得 Ct 值在15 左右的数据。除此外,可以使用TE Buffer 进行稀释,最低可稀释到0.01fM,用于标准曲线扩增或绝对定量试验。
常用内参miRNA荧光定量PCR试剂盒(染料法)
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