组织/细胞MICRORNA提取试剂盒

我公司的组织细胞microRNA(miRNA)提取试剂盒提取小RNA(＜200nt)具有操作步骤简单、重复性、产率较高的特点。核酸提取的成功与否、提取质量的好坏对后续实验起着至关重要的作用。使用TRIzol试剂提取总RNA，对总RNA中包含的部分小RNA进行研究，该方法的缺点是总RNA中microRNA的比例较小，同时由于mRNA的干扰，会导致后续反转录和RealTime PCR实验效率很低，很难获得理想的实验结果，且结果不可靠。为此，在探索miRNA分子功能的过程中开发了本试剂盒，使用该试剂盒提取的RNA中，长度在15～200nt范围的RNA在95%以上，基本不含有大RNA和DNA。使用该试剂通过一步上柱即可获得高纯度小RNA，可在45分钟内完成miRNA的提取。该试剂盒广泛适用于动物组织、细胞和多糖多酚含量不高的植物组织样本。

产品组成：

储存：室温可保存2年。
注意：miRNA Reagent A溶液中含有胍盐，其具有强烈的腐蚀性，试验时请务必佩戴防护眼镜、手套、口罩等防护措施，如有皮肤接触请立即用大量清水冲洗，再另行就医。

样本量及产量预期：

操作方法：
一、组织样本提取
1．向1.5ml EP管中加入300μl miRNA Reagent A。植物组织则再加入10μl β-巯基乙醇，混合均匀。
2．在液氮条件下充分将组织研磨粉碎，将一定的样品量（见样本使用量表）研磨成粉状的组织加入到上述300μl miRNAReagent A中，立即手腕用力震荡至组织粉末彻底溶解于裂解液中。室温静置 5分钟 以充分裂解细胞。
  注意：将组织加入到 miRNA Reagent A 后要迅速将组织震散，否则易引起组织成团状，不容易裂解。如发生成团状，务必用移液器将团状组织吹打松散。
3．向上述裂解完毕的裂解液中加入350μl miRNA Reagent B，上下颠倒混合均匀。13000rpm离心5分钟，吸取550μl上清液，转移到新的1.5ml EP管中。
4．向上述溶液中加入200μl无水乙醇，手腕用力震荡数次，室温放置 5分钟。
5．13000rpm离心10分钟，转移700μl上清液到新的1.5ml EP管中。
6．向上述溶液中加入300μl 异丙醇，手腕用力上下颠倒数次。
7．分两次将上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。
8．向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。
9．向吸附柱中加入500μl无水乙醇洗涤一次，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。
10．吸附柱 13000rpm 空离心2分钟，去掉残留的乙醇。
11．将吸附柱放入到新 1.5ml EP管中，室温放置 2分钟，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30μl RnaseFree TEBuffer，室温静置 2分钟，13000rpm离心2分钟，洗脱产物即为提取的miRNA。（通常取1～2μl该产物，即可使用我司一步法 miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应，货号：MT0006）。
二、细胞样本提取
1．贴壁细胞：胰酶消化细胞后，离心收集细胞沉淀。用100μl的1×PBS 重悬细胞后，加入300μl miRNA Reagent A颠倒混合均匀，室温放置 5分钟。
2．悬浮细胞：直接离心后，收集细胞沉淀。用100μl 1×PBS重悬细胞后，加入300μl miRNA Reagent A颠倒混合均匀，室温放置 5分钟。
3．向上述裂解完毕的裂解液中加入250μl miRNA ReagentB，上下颠倒混合均匀。13000rpm离心5分钟，吸取550μl上清液，转移到新的1.5ml EP管中。
  注意：加入细胞体积数与miRNA Reagent B总体积数为350μl。如加入50μl细胞，则miRNA Reagent B使用300μl。
4．向上述550μl上清溶液中加入200μl无水乙醇，手腕用力震荡数次，室温放置 5分钟。
5．13000rpm离心10分钟，转移700μl上清液到新的1.5ml EP管中。
6．向上述溶液中加入300μl 异丙醇，手腕用力上下颠倒数次。
7．分两次将上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。
8．向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。
9．向吸附柱中加入500μl无水乙醇洗涤一次，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。
10．吸附柱 13000rpm 空离心2分钟，去掉残留的乙醇。
11．将吸附柱放入到新 1.5ml EP管中，室温放置 2分钟，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30μl RnaseFree TEBuffer，室温静置 2分钟，13000rpm离心2分钟，洗脱产物即为提取的miRNA。（通常取1～2μl该产物，即可使用我司一步法 miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应，货号：MT0006）。


图例：小鼠肌肉组织的小RNA提取
 A1-A2：TRIzol试剂
 B1-B2：A公司microRNA提取试剂
 C1-C2：我司miRNA提取试剂盒。

常见问题：
1．本方法提取的小RNA，95％以上为小RNA（<200nt），有时会残留一些>200nt的RNA，通常残留的>200nt RNA不影响后续试验操作。
2．本试剂盒提取的小RNA由于不含mRNA等大分子量的RNA，因此更适合做后续反转录试验，从而进行定量试验。
3．使用本试剂盒提取的miRNA浓度通常在50ng/μl左右，取5～10μl即可用于电泳检测。取1～2μl即可用于我司TaqMan miRNA反转录试剂盒进行反转录反应（货号：MT0006），并使用我司优化的miRNA-TaqMan RealTime PCR技术（货号：MTTxxxxx）。