细菌基因组DNA提取试剂盒

细菌基因组DNA提取试剂盒（目录号：RTG2401）

● 试剂盒内容及保存：

● 储存条件和效期：

本试剂盒在室温（25℃左右）干燥条件下，可保存1年；更长时间的保存可置于2–8℃。2–8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。单独包装的蛋白酶K、溶菌酶和RNaseA收到后-20℃保存。

● 产品简介：

本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取细菌（革兰氏阳性菌和阴性菌）的基因组DNA。溶菌酶能有效去除细菌细胞壁；蛋白酶K能把核酸解离出来； RNaseA能去除痕量的RNA污染；离心吸附柱能够高效、专一吸附DNA，限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物，提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。

使用本试剂盒回收的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

● 提取得率：

● 准备工作：

1. 准备55℃和70℃水浴；无水乙醇；1.5ml灭菌离心管。

2. 按照标签所示在去蛋白液GD和漂洗液GW中加入无水乙醇，混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。

3. 每次使用前请检查缓冲液GA，缓冲液GB和去蛋白液GD是否有沉淀生成，如果出现沉淀，37℃温浴至沉淀溶解后再使用。

● 操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1. 取细菌培养液1–2 ml，10,000 g离心1分钟，尽量吸净上清；向细菌沉淀中加入180μl EB，旋涡混匀后加入18μl 溶菌酶，室温放置10-15分钟，期间间歇混匀几次。

注：溶菌酶的用量和处理时间与处理的细菌种类密切相关，用户可以根据细菌种类进行调节。如革兰氏阳性菌应将处理时间延长到30-60

分钟。

2.10,000g离心1分钟，吸弃大部分上清，留下约10 μl液体，彻底混匀。

   注：由于余留的液体较少，彻底混匀菌体不太容易，用手指弹动管壁附加枪头反复吹打既能完全混匀菌体。混匀一定要彻底，否则容易导致步骤8中离心柱堵塞。

3. 向菌体沉淀中加入200 μl缓冲液GA，混匀。

4. 向管中加入20 μl 蛋白酶K，混匀，55℃处理15-30分钟，期间间歇混匀2-3次至溶液清亮。

   注：加入蛋白酶K后会产生絮状物，消化彻底的标志是絮状物完全消失，溶液变清亮。如消化不彻底，会导致步骤8中离心柱堵塞。

5. 加入10 μl RNaseA（10 mg/ml）溶液，混匀后室温放置2分钟。

6. 加入220 μl缓冲液GB，混匀，70℃放置10-30分钟（对于革兰氏阳性菌，时间应延长到60分钟）。

注：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置相应时间后溶液会变清亮。如溶液未变清亮，应延长70℃处理时间。如果絮状物不能处理干净，容易导致步骤8中离心柱的堵塞。

7. 加入220 μl无水乙醇，充分混匀。

注：加入乙醇后会产生絮状沉淀，可用枪头反复抽打1-2次将沉淀弄碎后再上柱。如果絮状物未做处理，容易导致步骤8中离心柱的堵塞。

8. 将上一步所得溶液和絮状沉淀加入到吸附柱CG中（吸附柱放入收集管中），11,000g离心5分钟，倒掉废液，吸附柱CG放入收集管中。

注：如果出现吸附柱堵塞现象，可将离心时间延长到10分钟。

9. 向吸附柱CG中加入500 μl去蛋白液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），11,000 g离心2分钟，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。

10. 向吸附柱CG中加入700 μl漂洗液GW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），11,000 g离心60秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。

11. 向吸附柱CG中加入500 μl 漂洗液GW，11,000 g离心60秒，倒掉废液。

12. 吸附柱CG放回收集管中，11,000 g离心2分钟。

注：此步骤非常重要，其目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

13. 将吸附柱CG转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50–100 μl经70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，11,000 g离心2分钟。

注；① 洗脱缓冲液体积不少于50 μl，体积过小影响回收效率。

② 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。

14. DNA产物-20℃保存。

● DNA浓度及纯度检测：

基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。提取的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。可配制0.8-1.0％琼脂糖凝胶，使用λ/HindIII判断基因组的大小，完整的基因组大小应在23kb以上。使用分光光度计检测时， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7–1.9之间，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水洗脱，比值可能偏低，但并不表明DNA纯度不高。