名称 PhyZol? Total RNA Extraction Reagent 规格 PH1420-50 | 50mL PH1420-100 | 100mL 存储 Store@4℃ 避光,12个月有效。 产品简介 PhyZol?是Phygene自主研发和生产的用于细胞或组织的总RNA提取试剂。PhyZol?采用与Invitrogen TRIzol完全相似的原理和方法,PhyZol?颜色、抽提的方法和步骤亦与Invitrogen TRIzol完全相同。PhyZol?含酚和异硫氰酸胍等物质,能迅速裂解细胞或组织并且灭活核酸酶,保持RNA的完整性。加入氯仿并离心后,溶液形成上清层为水相(无色)、中间层、下层为有机相(红色)。上清层用异丙醇沉淀回收总RNA,中间层用乙醇沉淀回收DNA,下层用异丙醇沉淀回收蛋白。 Phygene的PhyZol?总RNA提取试剂适用于从各种组织或细胞中快速分离总RNA,既可用于小量样品(50~100 mg组织、5×106细胞),也可用于大量样品(>1g组织/>107细胞)。提取的总RNA质量高,可用于Northern blot、Dot blot、polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆。 PhyZol?具有以下特点: ①适用范围广; ②操作简单,整个过程1小时内完成; ③纯度高; ④污染少。 自备材料: 1、试剂:无水乙醇、氯仿、异丙醇、DEPC处理水等。 2、耗材: RNase广泛存在于人的皮肤上和体液及环境中,RNase是导致RNA降解的最主要物质,非常稳定。操作时应佩戴一次性口罩、手套、帽子。塑料制品、玻璃和金属物品、实验仪器等应清除RNase,移液器吸头、EP管等制品的RNase free处理尤为重要。 3、仪器:低温高速离心机、低温冰箱。 使用说明 操作步骤(仅供参考): 1、样品准备 ①贴壁细胞:接裂解:直接在培养瓶/皿中加入PhyZol?裂解细胞,每10cm2面积加1ml PhyZol?,用移液器吹打混匀。 胰蛋白酶消化:用无菌PBS洗涤细胞后,加入含有0.05~0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞,当细胞脱离容器壁后,加入含有血清的培养基终止反应,将细胞溶液转移至无RNase的离心管中,5000~6000g离心5 min,收集细胞沉淀,去除上清。收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净,否则裂解不完全,降低RNA收获率。 ②悬浮细胞:无需清洗细胞,直接5000~6000 g离心5 min,收集细胞。每5×106~107动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加入1ml PhyZol?。 ③组织:取新鲜动物或者植物组织或者-70℃冻存组织,50~100mg组织在液氮中充分研磨或者加入1ml PhyZol?研磨或者用匀浆器匀浆处理。样品体积一般不超过PhyZol?体积的10%。研磨要迅速,以1min为佳。 ④血液:取0.5~1 ml新鲜或冻存的血液,12000g离心5 min,去除血浆,加入1ml PhyZol?,充分振荡混匀。 2、核酸分离:充分振荡混匀(可以置于低温/超低温冰箱冻存5~10 min后,充分振荡,反复1~3次),将裂解样品或匀浆液室温放置5~10 min,使核蛋白与核酸完全分离。 3、样品分层:加入0.2 ml氯仿/1ml PhyZol?,剧烈振荡15 s,室温放置2~3 min。置于4℃离心机,12000 g离心10~15 min。上层为水相,中间层和下层为有机相,RNA在上层水相。 4、沉淀RNA:吸取上层水相(约500μl)转移至无RNase的离心管中(不要吸取任何中间层物质,否则会有染色体DNA污染),加入等体积异丙醇混匀,室温放置15~20 min。12000 g 4℃离心10 min,离心后管侧或管底形成胶状沉淀,弃上清。 5、洗涤RNA:加入1ml DEPC水配制的75%乙醇/1ml PhyZol?洗涤沉淀,室温放置5~10 min,7500g 4℃离心5 min,弃上清。室温干燥5~10 min,不宜过分干燥,否则RNA难以溶解。 6、溶解RNA:加入30~50ul RNase-free ddH2O充分溶解RNA,-70℃长期保存或直接用于后续试验。对于肝、胰腺、肾等组织中RNase含量高的样品,沉淀时用100%去离子甲酰胺溶解。 分析与定量: 1、测定样品在260 nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量。按1OD=40pg RNA计算RNA的产率。OD260/280在1.8~2.2视为抽提RNA纯度较好。浓度在4μg/ml以上的样品适于用分光光度计测定。 2、进行甲醛变性琼脂糖电泳,确定RNA的完整性和污染情况。 3、核酸分析仪测定RNA的质量和纯度。 应用举例 分别利用本品PhyZol?和Trizol从胶质细胞中提取Total RNA,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测,所提取RNA具有较好完整性, OD值均>1.9。 注意事项 1、样品保存:加入PhyZol?混匀后,样品可在-70℃放置1~2月;RNA样品可以在70%酒精中-70℃保存2~4周:如果需要长期保存,应置于超低温冰箱中保存。 2、PhyZol?是强腐蚀性物质,污染皮肤或眼睛后,立即用清水或生理盐水冲洗,必要时寻求医生的帮助。 3、PhyZol?可常温运输,建议保存4℃保存。 4、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 常见问题 可能原因 A260/ A280<1.6 抽提得到的RNA沉淀未完全溶解。 水相中混有有机相,从而存在蛋白质和DNA污染。 RNA样品用水而不是TE溶解。低离子浓度和低pH条件下,A280值会偏高。 样品匀浆时加的PhyZol?试剂太少,RNA与蛋白质、DNA未能完全分离。 匀浆后样品未在室温放置或者放置时间太短,RNA与核蛋白未完全解离。 DNA污染 样品中含组织溶剂(如乙醇等)或碱性溶液,致水相减少或pH升高。 样品匀浆时加入的试剂体积太少。如果存在DNA污染,可用DNA清除剂去除。 水相中混有有机相,从而存在蛋白质和DNA污染。 RNA产量低 样品裂解或匀浆处理不彻底,RNA没有被完全释放出来。 得到的RNA沉淀未完全溶解。 抽提的RNA中含有RNase。 RNA降解 组织或细胞不新鲜,样品没有及时被液氮冻存,导致组织或细胞中的RNA降解。 溶液或离心管未经RNase free处理,RNase的污染导致RNA被降解。 细胞在胰蛋白酶消化时间过长,导致未加PhyZol?前RNA已经部分降解。 电泳时使用的甲酰胺pH小于3.5,导致RNA发生酸解。 蛋白和多糖污染 水相中混有有机相,从而带有蛋白质和DNA。 样品中蛋白、多糖含量高或样品量太大,细胞未裂解完全。 *Important Note: This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications. 我们所提供的产品仅供科研使用,不得用于临床诊断、治疗、食品或者化妆品等用途!在您向我们订购产品之时,表明您已经知晓我们的产品仅做科研用途,并遵守法律法规!
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