细菌RNAout

细菌RNAout

产品及特点本产品是在动物 RNAout 基础上根据细菌提取的具体情况改良而得。它基于异硫氰酸胍/酚/氯仿提取RNA原理，可用于包括 E.coli、Campylobacterfetus、Pseudomonas aeruginosa、Rhodobacter sphaeroides 等各种常见的革氏阴性细菌。如果需要提革氏阳性细菌（如 Bacillus subtilis、Staphylococcusaureus 等）的 RNA，可以选择真菌 RNAout。本产品特点如下：

1. 操作简单快速，只要十分钟左右,可以全在室温下进行。

2. 所得 RNA 质量高,OD260/OD280 一般在 1.9，不含基因 DNA 污染。

3. 灵敏度高，可以从一个菌落中提取到普通电泳能够检测到的总 RNA。

4. 性价比高于进口同类产品。

细菌RNAout
规格及成分 成分 编号 100 次包装 250 次包装 
细菌 RNAout 51102 100 mL 250 mL
使用手册 1 份

细菌RNAout运输及保存 常温运输，4℃保存，有效期一年。

自备试剂 氯仿，异丙醇，75%乙醇，RNA 溶解液

使用方法 1. 在 1.5 mL 塑料离心管中离心收集 0.2-1.5 mL 新鲜细菌(注意:由于细菌RNA 半衰期十分短，所以，必须使用最新鲜细菌)，吸尽液体培养基，加 入1 mL 细菌 RNAOUT 并用枪充分吹打，确保细菌全部裂解，没有块状 物。如果使用菌落，则用接种环小心将其转移到装有 1 mL 细菌 RNAOUT 的1.5 m 塑料离心管中，用移液枪吹打均匀。在细菌数较少时，建议使 基因的助沉剂 RNADOWN 以提高 RNA 回收率。

2. 加入 0.2 mL 氯仿，在振荡器上充分振荡混均 30 秒（必须将管底的液体振荡起来，否则不能有效将 DNA 打断和去除蛋白质）。

3. 12000-15000 g 室温离心 3 分钟。上清液无色，下层液呈篮色，中间为 蛋白质。小心将上清液转移到另一干净 1.5 m 塑料离心管中，上清液体 积约为 0.6 mL。为避免触及中间层的 DNA 和蛋白质，建议分小量多次 吸取，并且只取 0.5 mL，留 0.1 mL 左右。当细菌数量较少时，中间层 十分松散，上清时很容易吸到下层有机相，需要更加小心。

4. 在上清液中加入等体积的异丙醇，振荡器上振荡混均 30 秒。

5. 12000-15000 室温离心 3-10 分钟，RNA 将在管底侧面形成沉淀。

6. 小心吸弃上清液，注意不要吸弃 RNA 沉淀。

7. 在离心管中加入 1mL 75%乙醇，振荡器上振荡混均 30 秒。

8. 12000-15000 g 室温离心 1 分钟。

9. 小心吸弃上清液，注意不要吸弃 RNA 沉淀。

10. 重复第 8 到第 10 步一次。

11. 短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留液（约 50 uL）。

12. 短暂放 1-2 分钟后加入适量 RNA 溶解液使 RNA 沉淀溶解，可以立即使用或存放于-80℃长期保存。

13. RNA 完整性的电泳检测：

如果需要做 Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行 RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的 RNA 分子（BioTechniques，28：414 ， 2000 ）。 如果是简单检测，可以使用 TAE 或基因的SuperBuffer-2 DNA/RNA 两用快速电泳液，但文献报道必须使用变性上样液（BioTechniques，9：558，1990）。普通 DNA 上样液不含变 性剂，也没经过去 RNase 处理，所以不要使用。 尤其需要注意的是不要使用 TBE 进行 RNA 电泳，因为 TBE 所含硼酸是研究多糖的经典方法----硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与 RNA 核糖中的羟基发生络合反应，形成 RNA 分子内或 RNA 分子间的络合复 合物，使同样长度的 RNA 具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有大的 RNA 络合复合物迟留在加样孔中（一般会误以为是基因组 DNA 污染）。RNA 分子内或 RNA 分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸与 RNA 的数量比例有关，而 RNA 样品中污染的其他多糖（如植物中提取的 RNA）也会参与此反应，使硼酸对RNA 电泳的影响更复杂，所以 TBE 对 RNA 电泳的影响没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，是避免使用。由于细菌细胞中 70-80%的 RNA 为 rRNA，后者又由 23S (约 3700nt)，16S (约 1700 nt)和 5S (约 100 nt)三种组成，所以变性胶电泳后应该 在 UV 下看见三条清晰的 rRNA 带。由于核酸长度与结合 EB 的数量成正比（当然还与 RNA 的二级结构有关，双链部分结合能力比单链部分强），所以 23S rRNA 条带的荧光强度一般比 16S rRNA 条带的荧光强度强 2倍。如果这两条 rRNA 带不清晰或比例小于此范围则表示 RNA 有降解（因为大的 RNA 被酶降解的可能更大）。

14. RNA 产量产率测定：

将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度（1 OD260 的RNA=40 μg/mL），进而计算出 RNA 的产量和产率。注意不要将 RNA 稀释在 DEPC 水中检测 OD260 和 OD280，否则光吸收比在 TE 中测得的低 10%-15%，因为核酸光吸收跟溶液 pH 相关，而 DEPC 水中的DEPC 高压分解后产生的 CO2 与水反应生成碳酸，使溶液 pH 降低进而降低 RNA 的光吸收。

15. RNA 纯度测定：
无污染的总 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)， OD260/OD230 一般在2.0-2.3 之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。蛋白质污染可以通过酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA 和多糖污染可以分别用基因的 DNAErasol 和 PS Erasol 去除。