RNase H
RNase H,即Ribonuclease H,中文名为核糖核酸酶H,是一种核糖核酸内切酶,可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。RNase H不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键,即不能消化单链或双链DNA或RNA。 特点:特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA,常用于cDNA第二链的合成。 用途:DNA-RNA杂合链中去除RNA,例如cDNA第二条链合成前去除mRNA;通过互补的DNA序列实现对RNA的定点剪切;除去杂交到poly(dT)上的mRNA中的poly(A);体外多腺苷酸化反应(polyadenylation reaction)产物研究。 来源:E.coli MRE-600细胞。 分子量:约18.4kDa(单体)。 活性定义:37℃20分钟内,能够催化1nmol杂合双链中的RNA形成酸可溶性核糖核苷酸形式所需的酶量定义为1个活性单位。 活性检测条件:20mM Tris-HCl(pH7.8),40mM KCl,8mM MgCl2,1mM DTT,24μM[3H]-poly(A).poly(dT), 0.03mg/ml BSA ,4%(v/v)glycerol。 纯度:不含DNA内切酶和外切酶,不含其它核糖核酸酶。 酶储存溶液:25mM HEPES-KOH(pH8.0),50mM KCl,1mM DTT,1mM EDTA,0.1mg/ml BSA,50%(v/v)glycerol。 Reaction Buffer(10X):200mM Tris-HCl(pH7.8),400mM KCl,80mM MgCl2,10mM DTT。 失活或抑制:65℃加热10分钟可使RNase H失活。金属离子螯合剂和巯基封闭剂均能抑制RNase H活性。 包装清单:
保存条件: -20℃保存。 注意事项: 酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明: 1. DNA-RNA杂合链中去除RNA: a. 用反转录酶,例如BeyoRT M-MuLV反转录酶或BeyoRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)合成cDNA条链,70℃孵育10分钟终止反应。 b. 在冰浴上向已经合成条链的20μl反应体系中依次加入如下试剂:
c. 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。 d. 37℃孵育1小时。 e. 加入2.5μl 0.5M EDTA(pH8.0)混匀,以终止反应。 f. 后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化合成的双链cDNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(D0033)可以向碧云天订购。 说明:其他情况DNA-RNA杂合链中去除RNA的条件可以参考上述条件进行。RNase H反应的pH范围约在7.5-8.3均可。 2. 杂合链中RNA的去除和cDNA第二链的合成: a. 用反转录酶,例如BeyoRT M-MuLV反转录酶(D7153)、BeyoRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)(D7159)或BeyoRT cDNA链合成试剂盒(RNase H-)(D7166)合成cDNA条链,70℃孵育10分钟终止反应。 b. 在冰浴上向已经合成条链的20μl反应体系中依次加入如下试剂:
c. 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。 d. 15℃孵育2小时。(注意:反应温度不能超过15℃) e. 加入5μl 0.5M EDTA(pH 8.0)混匀,以终止反应。 f. 后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化合成的双链cDNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(D0033)可以向碧云天订购。 注:Reaction Buffer(10X)for DNA Polymerase I:500mM Tris-HCl(pH 7.5 at 25℃),100mM MgCl2,10mM DTT。 3. 其他用途请参考上述用途或相关文献资料进行。
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