BeyoRT? M-MuLV反转录酶

BeyoRT™ M-MuLV反转录酶

BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(BeyoRT™ M-MuLV Reverse Transcriptase)是一种经过改造和优化的M-MuLV反转录酶。和普通的M-MuLV反转录酶相同，BeyoRT™ M-MuLV反转录酶也是一种依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶，可以以RNA或DNA为模板在引物存在的情况下完成互补DNA链的合成；同时具有Ribonuclease H(RNase H)酶活性，可以选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA，但不剪切单链RNA或双链RNA。
特点：BeyoRT™ M-MuLV反转录酶可以合成长达13kb的cDNA，而普通的M-MuLV反转录酶仅能合成长达9kb的cDNA；BeyoRT™ M-MuLV反转录酶的最适反应温度为42℃并且在50℃时仍然有很高活性，可以避免普通的M-MuLV反转录酶在37℃反应时的一些不足。
用途：BeyoRT™ M-MuLV反转录酶常用于在获得总RNA或mRNA后cDNA条链的合成。BeyoRT™ M-MuLV反转录酶合成的cDNA条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。BeyoRT™ M-MuLV反转录酶也可以用于DNA探针的标记，以及通过引物延伸(primerextention)来分析RNA。
来源：本BeyoRT™ M-MuLV反转录酶由大肠杆菌表达，表达的基因为经过突变优化的编码Moloney Murine Leukemia
Virus reverse transcriptase的pol基因片段。
活性定义：One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTMP into a polynucleotide fraction in 10 min at 37℃. Enzyme activity is assayed in 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 6 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 40 mM KCl, 0.5 mM dTTP, 0.4 MBq/ml [³H]-dTTP, 0.4 mM polyA·oligo(dT)_12-18。
纯度：不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含BeyoRT™ M-MuLV反转录酶本身含有的RNase H酶活力以外的RNA酶，满足常规反转录合成cDNA条链等的需要。
酶储存溶液：50 mM Tris, pH 8.3, 100mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.1% Triton X-100 and 50% glycerol。
Reaction Buffer(5X)：250 mM Tris, pH 8.3 at 25℃, 250 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 50 mM DTT。
失活或抑制：70℃孵育10分钟可以导致BeyoRT™ M-MuLV反转录酶失活；EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对BeyoRT™ M-MuLV反转录酶有抑制作用。
本产品用于体积为20微升的反转录体系时足够进行10次反转录反应。
包装清单：

保存条件：
-20℃保存。
注意事项： 
对于GC含量比较高的RNA的反转录，试剂盒的使用说明中给予了特别说明，请予以关注。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。 
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 
 

使用说明：
1.cDNA条链的合成(First-strand cDNA Synthesi)：
a.参考如下表格设置反转录反应：

*To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为13.7μl。注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应， 加入DEPC-treated Water混匀后微离心，接着可以在65℃孵育5分钟，随后立即置于冰浴以打开RNA的一些比较稳定的二级结构。
RNase Inhibitor可以视其本身的情况加入适当的量，例如0.5μl或其他适当体积。在加入其他体积时，DEPC-treated Water的用量需适当调整。
dNTP浓度不同时使用的体积需作适当调整，此时DEPC-treated Water的用量需适当调整。
b.轻轻混匀(可以用Vortex在最低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 如果使用Oligo(dT)₁₈作为引物或使用基因特异性引物，在42℃孵育60分钟。如果使用randomhexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10分钟，随后在42℃孵育60分钟。注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应，可以设置为45℃孵育60分钟。
d.70℃孵育10分钟以失活BeyoRT™ M-MuLV反转录酶并终止反转录反应。说明：对于长片段的cDNA不推荐采用加热的方法失活BeyoRT™ M-MuLV反转录酶，这种操作可能会导致部分长片段DNA被剪切。
e.反转录产物可以直接用于后续的PCR等反应，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为 50微升，则推荐使用2微升反转录产物。
2.其他用途请自行参考M-MuLV反转录酶的相关文献资料进行。
常见问题：
1.总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2.反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。