BeyoRT? III cDNA合成预混液(5X) (with gDNA EZeraser)

BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X) (with gDNA EZeraser)

信裕生物生产的BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X)，即BeyoRT™ III First Strand cDNA Synthesis Master Mix (5X) (with gDNA EZeraser)，是一种仅需加入RNA模板和水就能进行反转录的最简单、便捷、快速、稳定、高效并且能有效避免基因组DNA (genomic DNA, gDNA)干扰的的cDNA链合成产品。本产品对于3kb以下片段，10min就能完成反转录；产物长度可以长达12kb；可以在55℃进行高温反转录，有效解决复杂二级结构RNA反转录难的问题；-20℃不会结冻，取用非常便捷。
BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X) (with gDNA EZeraser)包含了经过改造和优化的快速高效(短至10min完成反转录)、热稳定(高达55℃)、高精确度、产物超长(长达12kb)的BeyoRT™ III M-MLV反转录酶、RNase Inhibitor、Oligo(dT)₁₈ Primer、Random Hexamer Primer、dNTPs、MgCl₂、反转录反应缓冲液能去除基因组DNA污染的gDNA EZeraser，只需加入RNA模板和水(DEPC-treated Water或DNase/RNase-Free Water)就能进行反转录反应，大大简化了反转录的实验操作，使操作最为便捷，能有效避免常规反转录非常复杂的操作过程中可能导致的操作误差、孔间污染等，使反转录的重复性和平行性大幅提升。
本产品可广泛用于获得总RNA或mRNA后cDNA条链的合成，后续可以用于PCR、real-time PCR也称定量PCR (quantitative PCR, qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建，尤其是反转录所得目的基因的克隆等。BeyoRT™ III cDNA链合成预混液(5X)还可以通过反转录用于DNA探针的荧光、生物素辛或同位素标记等，也可以通过引物延伸(primer extension)来分析和研究RNA。
本产品中的gDNA EZeraser其主要有效成分为热敏性dsDNase (Thermolabile dsDNAse)，能特异性地降解双链基因组DNA，效率高，作用时间短，在充分去除残留基因组DNA之后不会对cDNA造成显著影响。热敏性dsDNase在55℃加热5min就能导致完全失去酶活性。后续如果用于常规PCR或qPCR，PCR的首次变性条件能充分失活gDNA EZeraser，因此不必担心gDNA EZeraser对于后续的常规PCR或qPCR的干扰。使用本产品可以有效避免总RNA中的gDNA对于后续qPCR定量的干扰。另一方面，也有助于简化qPCR引物设计，无需进行跨内含子引物设计。
BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X) (with gDNA EZeraser)中的BeyoRT™ III M-MLV reverse transcriptase，是一种经过改造和优化的快速高效(短至10min完成反转录)、热稳定(高达55℃)、高精确度、产物超长(长达12kb)的M-MLV反转录酶，具有正常的依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶活性，能够以RNA或DNA为模板，在引物存在的情况下进行互补DNA链的合成，即可以进行cDNA(complementary DNA)的链合成，同时它保留了RNase H的活力，能选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA，有利于后续cDNA第二链的合成。
BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X) (with gDNA EZeraser)的反转录效率与非预混液的反转录效率一致(参考图1)。

图1. 使用信裕生物的BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X) (with gDNA EZeraser)和使用BeyoRT™ III M-MLV反转录酶的常规反转录体系的效果对比图。在20μl的反转录反应体系中，以HEK293T细胞中提取的1µg总RNA为模板，没有加入反转录酶、分别使用BeyoRT™ III M-MLV反转录酶的常规反转录体系和BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X) (with gDNA EZeraser)，42℃反转录60min。然后取1μl反转录产物分别进行两个目的基因(3.0kb的Fibrillin1基因和6.0kb的ADAR1基因)的PCR扩增和电泳检测。

如果希望进行常规的反转录操作，可以单独选购BeyoRT™ III M-MLV反转录酶(D7176),RNase Inhibitor (R0102)和dNTP mix (D7373)，或者选购BeyoRT™ III cDNA链合成试剂盒(D7178)进行反转录反应。
本产品经测试可以轻松完成长度为8 kb及以下基因的反转录，反转录的长度可以达到12 kb。BeyoRT™ III M-MLV反转录酶热稳定性好，反转录效率高。本产品最适反应温度为42℃，当温度达到50℃时仍具有很高活性，对于长度较短的cDNA反转录，温度达到55℃时也可获得较高产量的cDNA。高温反转录对于高GC含量RNA的反转录，能有效减少二级结构，提升反转录效率。本产品反转录速度快，6kb以下的cDNA反转录只需0.5h即可完成，3kb以下的cDNA反转录10min即可完成。
本产品操作便捷，作为即用型链合成预混液(5X)，即反转录预混液(5X)，只需加入模板RNA和水，即可快速进行反转录反应，并且BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X) (with gDNA EZeraser)在-20℃不会结冻，使用非常便捷。
本产品重复性好，反转录所有试剂预混合，大大减少操作步骤，有效降低污染几率和操作误差，使实验结果更加一致，重复性更好。
失活或抑制：80℃孵育10min可以导致本产品中的BeyoRT™ III M-MLV反转录酶失活；EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对BeyoRT™ III M-MLV反转录酶有抑制作用。55℃孵育5min可以导致本产品中的gDNA EZeraser失活。
本试剂盒的不同包装分别足够进行20次、100次和500次反转录反应。
包装清单：

保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
对于GC含量比较高的RNA的反转录，产品的使用说明中给予了特别说明，请予以关注。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
 

使用说明：
1. cDNA条链的合成(First-stand cDNA Synthesis)：
a. 参考如下表格中设置的20μl反转录体系：

*To 16μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为16μl。
b. 轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 42℃孵育10-60min。反转录3kb以下的cDNA，反转录10min即可，反转录3-6kb的cDNA，反转录30min即可，而6kb以上的cDNA推荐反转录60min。后续用于qPCR时，检测任何长度的基因，通常反转录10min就足够了。注意：对于GC含量较高或二级结构比较严重的模板RNA，可以50℃反转录60 min，以充分利用本产品反转录酶在50℃时仍有良好的反转录酶活性这一特点，在较高温度进行反转录可以有效减少二级结构的干扰。如果拟在50℃或更高温度进行反转录，推荐先在37℃孵育2min以充分去除基因组DNA污染，然后再在50℃或更高温度进行反转录，因为50℃或更高温度会导致gDNA EZeraser快速失活。
d. 80℃孵育10 min以失活反转录酶并终止反转录反应。说明：对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶，该方法易导致部分长片断DNA被剪切，此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
e. 反转录产物可以直接用于后续的PCR反应等，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为20μl和50μl，则推荐相应地使用0.8μl和2μl反转录产物。
2. 引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶的相关文献资料进行。

常见问题：
1. 总RNA反转录产物电泳观察不到。
a. 反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，并且总RNA的反转录产物大小很不均匀，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
a. PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
b. 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0，则提示总RNA发生了显著的降解，能重新制备总RNA样品。避免RNA降解的主要方法是，严格进行RNA的相关操作，包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA，以尽量避免RNase污染。
c. 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用信裕生物的BeyoZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
d. 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增，通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
e. 如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构，此时可以考虑把反转录温度提高到45-55℃。