酵母质粒小量抽提试剂盒

酵母质粒小量抽提试剂盒

信裕生物生产的酵母质粒小量提取试剂盒(Yeast Plasmid Mini Preparation Kit)是一种使用破壁酶(Lyticase)消化去除酵母细胞壁，然后采用一种新型的酵母质粒纯化柱实现从酵母细胞中进行小量质粒快速抽提的试剂盒。
无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，12个样品只需约1-1.5小时即可完成。
试剂盒提供了破壁酶(Lyticase)，酵母收集后，加入Lyticase消化去除细胞壁，接着采用传统碱裂法裂解细胞，然后将获得的上清液转移至结合柱结合DNA，经过离心快速洗涤，最后用洗脱液洗脱出酵母质粒DNA。
由于采用了高浓度的破壁酶，无需再使用玻璃珠，可以避免因为玻璃珠的机械作用带来的酵母基因组DNA污染。
每个质粒纯化柱可以结合的质粒量的上限约为20微克。质粒DNA的产量依赖于酵母携带质粒的拷贝数，酵母菌株以及生长条件。通常酵母质粒的拷贝数较低，1.5-5ml培养过夜的酵母抽提获得的质粒DNA量约为1-3微克左右。高拷贝酵母质粒抽提时的得率会大大提高。抽提所得质粒的量与酵母培养浓度、质粒拷贝数、酵母品系等因素有关。
使用本试剂盒抽提得到的酵母质粒DNA可用于各种常规分子生物学实验，如转化、PCR、基于PCR的突变、体外转录、酶切、测序、文库筛选等。
包装清单：

保存条件：
D0029-8需-20℃保存，其余室温保存，一年有效。D0029-8为粉末，短时间4℃存放不影响其活性。D0029-8配制成Lyticase溶液后4℃可以保存1个月，-20℃可以保存6个月。
注意事项：
次使用前把试剂盒提供的RNase A全部加到溶液Ⅰ(悬浮液)中，混匀，并在瓶上做好标记。加入RNase A后4℃存放。
次使用前在每瓶溶液Ⅳ(洗涤液)中加入27ml无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
次使用前吸取1ml Lyticase配制液到Lyticase粉末中，完全溶解后即为Lyticase溶液。配制好的Lyticase溶液4℃可以保存1个月，-20℃可以保存6个月。如需-20℃保存，能适当分装。Lyticase溶液配制后或冻存后再溶解可能会出现轻微混浊，属正常现象，请混匀后使用。
温度较低时，溶液Ⅱ和溶液Ⅲ可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀，37℃水浴加热溶解，混匀后使用。溶液Ⅱ请勿过分剧烈混匀，否则会产生大量气泡。
溶液Ⅱ使用完后，一定要盖紧瓶盖，防止被空气中二氧化碳酸化。
溶液II有强碱性，溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和Lyticase对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。
本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 取过夜菌至50毫升离心管内，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。
通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清，再倒入约50毫升菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过150毫升，对于低拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过200毫升。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。
2. 每管加入5毫升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。
确认溶液I中已添加了RNase A。最高速度vortex 10-20秒或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开，或手指把沉淀弹开。
3. 每管加入5毫升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，室温放置1-2分钟，使细菌完全裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后，溶液应变得透明，无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，再室温放置2-3分钟，但总裂解时间不可超过5分钟。
4. 每管加入7毫升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。
切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致最终所得质粒的质量下降。
5. 12,000-14,000rpm)室温离心10分钟。
如果离心机的最高速度较低，需要适当延长离心时间，例如约5000-6000rpm时需要离心20-30分钟或更长时间，直至沉淀充分。离心时可以准备好质粒纯化柱，自制漏斗等，并在纯化柱上标上记号。
6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。12,000-14,000rpm离心2分钟，倒弃收集管内液体。
质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。本步骤及后续需要12,000-14,000rpm离心2分钟的步骤，如果离心机的最高速度较低，需要适当延长离心时间，例如约5000-6000rpm时需要离心约5分钟或更长时间，直至液体全部穿柱。如果离心后有少量漂浮物，可以考虑再次离心，或者使用擦镜纸两次对折后打开形成的自制漏斗，以过滤去除漂浮物。
7. 在质粒纯化柱内加入12毫升溶液IV，12,000-14,000rpm离心2分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体。
加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。
8. 12,000-14,000rpm再次离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。
9. 将质粒纯化柱置于50毫升离心管上，加入2毫升溶液V至管内柱面上，放置2分钟。
也可以用重蒸水或MilliQ级纯水替代溶液V，但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。如想得到较高浓度的质粒，可以加入1毫升溶液V洗脱，质粒得率实测减少约5-10%，具体减少量与特定样品有关。
10. 12,000-14,000rpm离心2分钟，所得液体即为转细胞级超纯质粒。
通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml左右，可以用于细胞转染。如果想得到高浓度的质粒，可以采用如下的异丙醇沉淀方法浓缩质粒或常规的乙醇沉淀方法。
a. 加入0.7倍体积的常温异丙醇(例如1毫升待浓缩质粒中加入0.7毫升异丙醇)，混匀后1,2000-14,000rpm 4℃离心10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀。
如果希望获得较高浓度的质粒，在洗脱时推荐采用1毫升洗脱液进行洗脱，后续可以转移到2毫升离心管内进行异丙醇沉淀，这样操作起来相对比较方便。异丙醇沉淀的DNA为玻璃状近透明的颗粒状沉淀，和乙醇沉淀产生的含盐沉淀物相比较难观察清楚。离心后取放离心管要尽量轻柔，避免沉淀松动或部分颗粒状悬浮至溶液中。不推荐直接倒弃上清，直接倒弃上清时经常出现直接把质粒沉淀倒掉的情况；如果偏好直接倒弃上清，建议把上清倒弃至一洁净离心管内，这样万一沉淀被倒出，仍然可以从洁净离心管中回收。推荐用移液枪吸去上清，并注意尽量避免吸走沉淀。
b. 加入1毫升常温70%乙醇溶液，轻轻悬起质粒沉淀以充分洗涤，12,000-14,000rpm 4℃离心5-10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀。
c. 5,000-10,000rpm 4℃离心5-10秒，用20微升或200微升移液器小心吸净残留液体，避免触及沉淀。
d. 肉眼观察无明显液体后(吸净液体后通常在1分钟内即可完成干燥)，加入适当体积的溶液(如溶液V、10mM Tris-Cl pH8.5或Milli-Q级纯水)溶解DNA。
DNA样品不能过于干燥，否则很难溶解。在弱碱性条件下溶解DNA，溶解时可用缓冲液反复冲洗管壁，使管壁上的DNA充分溶解。

附表1. EndA^- and EndA⁺ strains of E. coli.

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