背景[1-3]
ANTI-PARKIN抗体是ANTI-PARKIN为抗原制得的免疫抗体，可以特异性结合PARKIN。主要用于检测PARKIN的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多种免疫学实验。
分子遗传学研究证明parkin基因是常染色体隐性遗传性少年型帕金森综合征(AR-JP)的致病基因,其表达产物parkin蛋白具有E3泛素-蛋白连接酶活性.Parkin蛋白可能在维持多巴胺能神经元的正常功能中发挥重要作用,而parkin蛋白功能障碍可能与帕金森病的发病有关。
目前已经鉴定了几种parkin蛋白的底物蛋白,使我们能够初步了解帕金森病发病的分子和细胞学机理,这对于我们最终搞清帕金森病的发病机制、开发相应的治疗药物具有极其重要的意义。
过度表达的parkin可能通过增强对底物蛋白的泛素化而加强其降解，减少由α-synuclein过度表达产生的细胞毒性。parkin是散发性PD患者脑中选择性S-硝基化的蛋白。氧化和硝基化应激促进parkin蛋白的S-硝基化，从而破坏了parkin的E3泛素连接酶功能和神经保护作用。
而UPS功能缺陷会导致错误折叠的α-synuclein单体及寡聚体降解受阻、胞浆内LB的形成及多巴胺神经元变性死亡。α-synuclein聚集后可损害蛋白酶体系统。α-synuclein低聚体结合位于蛋白酶体外围的帽状结构19S亚单位S6，由于聚集状态的α-synuclein体积大且以共价键交联结合，会抑制其它蛋白结合并影响20S的功能，导致异常蛋白聚集。可见，α-synuclein聚集与UPS功能缺陷互为因果，加速了胞浆内LB的形成及多巴胺神经元变性死亡。
应用[4][5]
用于Pink1/Parkin介导的线粒体自噬在糖尿病心肌病中的作用研究
构建糖尿病心肌病模型,观察Pink1/Parkin通路及线粒体自噬水平在糖尿病心肌病中的变化。利用Parkin基因敲除小鼠和培养原代心肌细胞,在在体和离体水平明确Pink1/Parkin通路是否参与糖尿病心肌损害的发生。原代心肌细胞过表达Parkin后给予自噬抑制剂3-MA,证实Pink1/Parkin通路通过调节线粒体自噬参与糖尿病心肌病的发生。
【研究方法】1.挑选40只8周龄,体重18~22g的C57雄性小鼠,随机分为2组:正常组(Control)和糖尿病心肌病组(DM)。2.DM组小鼠每天以50 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ),连续注射5天,检测空腹血糖大于11.1mmol/L确定为糖尿病造模成功。造模成功后,继续饲养8周,建立糖尿病心肌病模型。超声检测小鼠心脏功能。
3. HE和MASSON染色观察心肌组织的病理改变。4.TUNEL法检测心肌组织中心肌细胞的凋亡。5.透射电镜下观察小鼠心肌组织中线粒体的形态和自噬体的形成。6.Western-blot检测心肌组织中Pink1、Parkin、Mfn1、Mfn2、Nix、Beclin1、P62、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的蛋白水平。
7. 将C57和Parkin-/-小鼠随机分为四组:正常C57小鼠组(WT),糖尿病C57小鼠组(WT-STZ),正常Parkin基因敲除小鼠组(Parkin)和糖尿病Parkin基因敲除小鼠组(Parkin-STZ)。糖尿病模型建成后,继续饲养8周。8周末,超声检测各组小鼠的心功能。
8. 培养原代心肌细胞,随机分为以下6组:A:阴性对照组(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Lac Z;B:正常Parkin过表达组(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Parkin;C:正常Parkin过表达+3-MA干预组(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Parkin+3-MA;D:高糖阴性对照组(33 mmol/L葡萄糖):HG+Lac Z;E:高糖Parkin过表达组(33 mmol/L葡萄糖):HG+Parkin;F:高糖Parkin过表达+3-MA干预组(33 mmol/L葡萄糖):HG+Parkin+3-MA。9.TUNEL法检测原代心肌细胞的凋亡。
10.透射电镜下观察原代心肌细胞中线粒体的形态和自噬体的形成。11.荧光显微镜观察心肌细胞中GFP-LC3阳性的细胞数。12.Western-blot检测心肌细胞中Pink1、Parkin、Mfn1、Mfn2、Drp1、Nix、Beclin1、P62、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的蛋白水平。
参考文献
[1]Autophagy and mitophagy in diabetic cardiomyopathy[J].Satoru Kobayashi,Qiangrong Liang.BBA-Molecular Basis of Disease.2014
[2]A novel protective mechanism for mitochondrial aldehyde dehydrogenase(ALDH2)in type i diabetes-induced cardiac dysfunction:Role of AMPK-regulated autophagy[J].Yuli Guo,Wenjun Yu,Dongdong Sun,Jiaxing Wang,Congye Li,Rongqing Zhang,Sara A.Babcock,Yan Li,Min Liu,Meijuan Ma,Mingzhi Shen,Chao Zeng,Na Li,Wei He,Qian Zou,Yingmei Zhang,Haichang Wang.BBA-Molecular Basis of Disease.2014
[3]Mitochondrial Fusion Directs Cardiomyocyte Differentiation via Calcineurin and Notch Signaling[J].Atsuko Kasahara,Sara Cipolat,Yun Chen,Gerald W.Dorn,Luca Scorrano.Science.2013(6159)
[4]Targeting the upregulation of reactive oxygen species subsequent to hyperglycemia prevents type 1 diabetic cardiomyopathy in mice[J].Karina Huynh,Helen Kiriazis,Xiao-Jun Du,Jane E.Love,Stephen P.Gray,Karin A.Jandeleit-Dahm,Julie R.McMullen,Rebecca H.Ritchie.Free Radical Biology and Medicine.2013
[5]王佳兴.Pink1/Parkin介导的线粒体自噬在糖尿病心肌病中的作用[D].第四军医大学,2015.