背景[1-3]
免疫染色二抗稀释液是一种用于免疫染色实验中稀释二抗的试剂。其主要目的是通过稀释抗体来防止抗体效价下降，并减少抗体在组织上的非特异性吸附。这种稀释液通常由TBS（Tris Buffered Saline，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液）、明胶、BSA（牛血清白蛋白）、防腐剂等成分组成。
使用免疫染色二抗稀释液时，需要参考所用的二抗的说明书，以及样品中目的蛋白的含量，按照适当的比例（如1:1000至1:500）稀释二抗。稀释后的二抗可以直接用于非荧光免疫染色实验。此外，一次免疫染色结束后，可以回收稀释的二抗，在4℃保存，以便下次使用。根据不同的产品说明，稀释后的二抗可以在一定的时间范围内（如1至2周）重复使用数次。
免疫染色二抗稀释液
免疫染色二抗稀释液通常用于稀释荧光或酶标记的二抗，以减少非特异性结合并提高信号强度。以下是一些建议和注意事项：
选择适当的稀释液：常用的稀释液有PBS、TBS、Tween-PBS等。选择哪种取决于您使用的一抗和二抗的特性。
避免过度稀释：虽然稀释可以提高信号强度，但过度稀释可能会导致信号太弱或背景噪音增加。建议从较高的浓度开始，然后逐渐稀释到所需的浓度。
考虑pH值：某些抗体可能对pH值敏感。在稀释之前，检查二抗的说明书或与供应商联系，了解推荐的pH范围。
避免使用含有叠氮钠的缓冲液：叠氮钠是一种常用的防腐剂，但它可能会与某些荧光染料反应，导致信号减弱或消失。
储存：一旦稀释，建议尽快使用。如果需要储存，应将其存放在4°C，并在24小时内使用。避免多次冻融。
检查非特异性结合：在正式实验之前，可以使用没有一抗的样品进行预实验，以检查二抗的非特异性结合。
考虑背景噪音：确保您的样品制备和洗涤步骤足够严格，以减少背景噪音。
使用对照：为了确保实验的准确性，建议使用适当的对照，如阳性对照、阴性对照和无关抗体对照。
考虑二抗的浓度：根据实验的需要和一抗的浓度，可能需要调整二抗的浓度。通常，从较低的浓度开始，然后逐渐增加，直到获得最佳信号。
避免交叉反应：确保您使用的二抗与您的一抗是特异性匹配的。如果可能的话，进行交叉反应测试。
应用[4][5]
免疫染色二抗稀释液可以用于基于Mhp336蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法的建立
猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法的建立目的:建立较为灵敏的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法。
方法:首先确定检测方法的最佳反应条件,包括抗原包被浓度的确定、封闭液的选择、封闭时间的确定、一抗稀释比例、一抗孵育时间、免疫染色二抗稀释液稀释比例、二抗孵育时间、显色时间和检测方法的判定标准。然后进行批内重复性试验、批间重复性试验、特异性试验和灵敏性试验。最后用建立的方法对226份临床猪血清样品进行检测,并与本实验室前期建立的基于Mhp366蛋白的ELISA抗体检测试剂盒以及IDEXX公司的Mhp抗体试剂盒进行比较。
结果:确定抗原包被浓度为0.05μg/mL,封闭液为2.5%脱脂奶粉,封闭时间为1h,一抗稀释比例为1:500,一抗孵育时间为0.5 h,免疫染色二抗稀释液稀释比例为1:10 000,二抗孵育时间为1h,显色时间为5 min,检测方法的临界值为0.332。批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均低于7%,特异性和灵敏性良好。226份临床临床猪血清样品的检测结果表明本研究建立的检测方法具有较高的灵敏性。结论:建立了基于Mhp336蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法,该方法具有良好的重复性,特异性和灵敏性。该方法的灵敏性高于本实验室前期建立的检测方法。
参考文献
[1]Development of an ELISA for distinguishing convalescent sera with Mycoplasma hyopneumoniae infection from hyperimmune sera responses to bacterin vaccination in pigs.[J].Ding Honglei;Wen Yukang;Xu Zuobo;Zhou Bingqian;Tlili Chaker;Tian Yaqin;Wang Zhaodi;Ning Yaru;Xin Jiuqing.Veterinary medicine and science,2021
[2]Perspectives for improvement of Mycoplasma hyopneumoniae vaccines in pigs[J].Maes Dominiek;Boyen Filip;Devriendt Bert;Kuhnert Peter;Summerfield Artur;Haesebrouck Freddy.Veterinary Research,2021
[3]Pathogenicity&virulence of Mycoplasma hyopneumoniae.[J].Leal Zimmer Fernanda M A;Paes Jéssica Andrade;Zaha Arnaldo;Ferreira Henrique Bunselmeyer.Virulence,2020
[4]Functional Identification and Structural Analysis of a New Lipoate Protein Ligase in Mycoplasma hyopneumoniae.[J].Zhu Kemeng;;Chen Huan;;Jin Jin;;Wang Ning;;Ma Guixing;;Huang Jiandong;;Feng Youjun;;Xin Jiuqing;;Zhang Hongmin;;Liu Henggui.Frontiers in cellular and infection microbiology,2020
[5]董青霜.基于Mhp336蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法的建立[D].西南大学,2024.