甲醛脱氢酶(Formaldehyde Dehydrogenase,FDH)试剂盒说明书
分光光度法50T/48S
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
甲醛脱氢酶(Formaldehyde Dehydrogenase,FDH)试剂盒测定意义:
甲醛是一种能与蛋白质、核酸和脂类产生非特异性反应的活泼化合物,对所有生物都具有很高毒性。甲醛脱氢酶作为含锌中等链醇脱氢酶(ADH)的家庭成员之一,广泛存在于原核和真核生物中,该酶能利用NAD+作为辅酶,将有毒的甲醛氧化,是甲醛氧化途径中的关键酶。
测定原理:
甲醛脱氢酶催化甲醛和NAD+产生NADH,在340nm处的吸光值会增加,测定340nm处的吸光值变化,可计算得到甲醛脱氢酶的活性。
自备实验用品及仪器:
天平、离心机、分光光度计、1mL玻璃比色皿、蒸馏水。
甲醛脱氢酶(Formaldehyde Dehydrogenase,FDH)试剂盒试剂组成和配制:
提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体30mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入15mL水溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入3mL水溶解待用。
试剂四:液体3mL×1瓶,4℃避光保存。
FDH提取:
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃,离心20min。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 液体:直接检测。
甲醛脱氢酶(Formaldehyde Dehydrogenase,FDH)试剂盒测定操作表:
1、 分光光度计预热30min,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 操作表
在比色皿中加入如下试剂
| 测定管 |
样本(µL) | 100 |
试剂一(µL) | 550 |
试剂二(µL) | 250 |
试剂三(µL) | 50 |
试剂四(µL) | 50 |
混匀,于340nm下测定初始吸光值A1与5min后的吸光值A2,△A=A2-A1。
若样本数量较多,可将试剂按比例配成工作液使用。
FDH酶活计算:
(1)按蛋白浓度计算
酶活定义:每毫克蛋白每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。
FDH酶活(nmol/min/mg prot)= ×V反总÷(V样×Cpr)÷T = 322×△A÷Cpr
(2)按样本质量计算
酶活定义:每克样品每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。
FDH酶活(nmol/min/g 鲜重)= ×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T =322×△A÷W
(3)按照细胞数量计算
酶活定义:每104个细胞每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。
FDH酶活(nmol/min/104cell)= ×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量(万个))÷T= 322×△A÷细胞数量
(4)按液体体积计算
酶活定义:每mL样本每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。
FDH酶活(nmol/min/mL)= ×V反总÷V样÷T=322×△A
:NADH微摩尔消光系数,6.22×10-3 L/µmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,1mL;V样:反应体系中样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T,反应时间,5min;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g
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