植酸酶（phytase）试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
植酸酶（phytase）试剂盒测定意义：
植酸酶（phytase）是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶，它能将食品和饲料中植酸及其盐转化为可供有机体利用的有效磷，降低粪便中的磷含量，减轻对环境的污染，改善营养成分的吸收和利用，因此具有极其广泛的研究和应用价值。
测定原理：
植酸酶在一定温度和pH值条件下，水解底物植酸钠生成无机磷与肌醇衍生物，无机磷在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色复合物，在700nm处有特征吸收峰，根据700nm处吸光值变化可计算得植酸酶活性。
自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅，超声溶解器，回旋式振荡器。
试剂组成和配制：
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
缓冲液：液体25mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存，临用前加缓冲液10mL配制，现用现配；用不完的试剂4℃保存一个月。
试剂二：液体25mL×1瓶，4℃保存。
显色剂：粉剂×6瓶，4℃保存，临用前根据用量每瓶加1mL双蒸水溶解，再加4mL试剂二混匀。
样本处理：
1. 酶制剂：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：500~1000的比例（建议称取约0.001g，加入1mL提取液）加入提取液，在超声波溶解器上溶解15min，再用回旋式振荡器振荡15min，待测。
2. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，在超声波溶解器上溶解15min，再用回旋式振荡器振荡15min，4℃，4000g离心10min，取上清待测。
3. 饲料样品：饲料烘干粉碎，过40目筛，按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，在超声波溶解器上溶解15min，再用回旋式振荡器振荡15min，4℃，4000g离心10min，取上清待测。
4. 培养液等液体样品，混匀直接测定。
植酸酶（phytase）试剂盒测定操作表：
| 对照管 | 测定管 |
样本（µL） | 100 | 100 |
37℃温育5min |
缓冲液（µL） | 400 |
|
试剂一（µL） |
| 400 |
混匀，37℃温育30min |
95℃，10min终止反应，冷却至室温 |
显色剂（µL） | 500 | 500 |
混匀，37℃静置15min，10000g，室温，离心5min，取上清，蒸馏水调零，测定700nm处吸光值，△A=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。 |
酶活性计算公式：
标准曲线：y = 0.2764x + 0.0082，R2 = 0.9998；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值。
1． 按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在37℃，pH5.5的条件下，每毫克蛋白每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性（μmol/min/mg prot）=（△A-0.0082）÷0.2764÷Cpr÷T =0.1206×（△A-0.0082）÷Cpr2．按照样本质量计算
酶活性定义：在37℃，pH5.5的条件下，每克样本每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性（μmol/min /g 鲜重）=（△A-0.0082）÷0.2764÷W÷T =0.1206×（△A-0.0082）÷W
3. 培养液等液体样品
酶活性定义：在37℃，pH5.5的条件下，每毫升液体每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性（μmol/min /mL）=（△A-0.0082）÷0.2764÷T =0.1206×（△A-0.0082）
Cpr：样本蛋白含量，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min。
注意事项：
1、显色剂需要临用前根据用量配制，每一瓶是10个样本的用量，新配制的显色剂若有颜色则已经污染或者试剂过期，应放弃使用。
2、ΔA线性范围为0.01-2。
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