背景及概述[1]
臭灵丹(Laggerapterodonta)菊科六棱菊属植物，又名鹿耳林或大黑药，以根或全草入药，全草有小毒。夏秋采收，洗净，鲜用或晒干。全株有强烈臭气。始载于《滇南本草》“其味苦、辛，性寒，有毒。阴中之刚也，治风热积毒，脏腑不和。通行十二经络，发散疮痈”，分布于云南、四川、西藏等地，云南彝族首先使用其入药，具有清热解毒、消肿排脓之功效，且应用广泛。臭灵丹中的桉烷型倍半萜化合物多为桉烷型倍半萜酸、桉烷型倍半萜醇及桉烷型倍半萜苷类化合物，目前已从臭灵丹中分离、鉴定30余种桉烷型倍半萜类化合物，其中桉烷型倍半萜酸主要包括臭灵丹酸、臭灵丹酮酸、2α，3β－二羟基－臭灵丹酸等，以臭灵丹酸为主；桉烷型倍半萜醇主要包括臭灵丹二醇、臭灵丹三醇甲及臭灵丹三醇乙等，以臭灵丹二醇为主；桉烷型倍半萜苷类化合物是由桉烷型倍半萜取代羟基而形成的糖苷类化合物。
制备[2-3]
方法1：一种从臭灵丹中提取臭灵丹酸的工艺，步骤包括：将臭灵丹根烘干至含水低于13％，取1kg粉碎至40目，得臭灵丹粉末，以5％氢氧化钠水溶液6L室温下浸提12小时，过滤得浸取液，加入2％醋酸酸化至pH为2，得沉淀物；收集沉淀物，将沉淀物以氯仿萃取3次，将氯仿层旋转蒸发减压浓缩至萃取体积的1/20，加入大孔树脂成粉末状，然后上大孔吸附树脂柱进行柱层析，用体积比为3∶1的乙酸乙酯和甲醇的混合洗脱液进行洗脱；收集富集臭灵丹酸的流分，浓缩后再加入大孔树脂拌样上柱，用体积比为6∶1、3∶1、1∶1的石油醚-乙酸乙酯的混合溶剂进行梯度洗脱，收集流分，旋转蒸发，浓缩得臭灵丹酸，含量为87％，进一步用少量丙酮溶解所得产物，重结晶得到纯度98.7％的无色晶体。
方法2：取臭灵丹干燥药材(采自昆明市近郊)1kg，通过90％酒精渗漉提取得浸膏135g；浸膏加800ml水搅拌使混悬，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取(各5×500ml)，回收溶剂；将石油醚提取物加硅胶适量拌样，干法装柱(200～300目，650g)，常压下用石油醚‐醋酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，溶剂配比依次为1：0、20：1、10：1和5：1；分别接收，浓缩；石油醚洗脱段重约3.8g，继续用硅胶柱层析反复分离，交替使用石油醚和氯仿洗脱，用TLC指导合并(碘熏显色)，浓缩，得到白色结晶性粉末(0.1g)，经NMR波谱解析鉴定为臭灵丹酸。
应用[3-4]
臭灵丹酸具有抗菌、抗肿瘤等生物活性。
1)抑菌作用：对臭灵丹进行幽门螺杆菌的体外抑菌实验，结果显示臭灵丹水浸泡提取物具有明显抑菌效果。使用滤纸扩散法检测臭灵丹酸、臭灵丹二醇抑菌活性，结果发现，此两种化合物具有明显抑制金黄色葡萄球菌、草分支杆菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单孢菌、环状芽胞杆菌的作用。
2)抗病毒实验：本发明采用细胞病变抑制法在治疗模式下验证臭灵丹酸对流感病毒复制的抑制作用，以奥司他韦为阳性对照药，观察臭灵丹酸对MDCK细胞的毒性以及对流感病毒复制的抑制作用。利用MTT法测得臭灵丹酸的半数有毒浓度(TC)为278.9μg/mL，臭灵丹酸抑制多个亚型流感病毒(A/PR/8/34、09H1N1、季H1N1等)的半数有效浓度IC为9.47～37.14μg/mL，证实臭灵丹酸在治疗模式下对流感病毒有明显抑制作用，其选择指数SI＝7.5～29.5，为低毒高效。流感病毒神经氨酸酶(NA)抑制实验表明臭灵丹酸对NA的抑制活性，IC＝668.1μg/ml。免疫荧光实验显示臭灵丹酸(100μg/mL)可抑制流感病毒RNPs核输出。
3)抗炎实验：应用稳定转染的NF‐κB启动荧光素酶表达的报告质粒的HEK293细胞系研究臭灵丹酸对流感病毒诱导的与病毒复制相关信号通路的调控作用，分别用20ng/ml的TNF-α和流感病毒H1N1刺激，同时给予不同剂量臭灵丹酸(20μg/ml、40μg/ml)干预，均发现药物可抑制NF‐κB介导的荧光素酶的表达，并呈剂量依赖关系。提示药物具有抑制NF‐κB信号通路活化的药理活性。由于NF‐κB信号通路激活与促炎因子的高表达密切相关，因此通过qRT-PCR方法测定臭灵丹酸对于流感病毒感染后介导的促炎因子表达的实验证实，不同剂量臭灵丹酸(6.25μg/ml、25μg/ml、100μg/ml)能够明显抑制H1N1病毒和H9N2病毒感染A549细胞炎症因子(IL-6、IP-10、MIP-1、MCP-1)的异常表达，并呈剂量依赖关系。
主要参考资料
[1] 云南民间常用药臭灵丹的研究概述
[2] CN201010293234.1一种从臭灵丹中提取臭灵丹酸的工艺
[3] CN201710544207.9臭灵丹酸在制备预防或治疗流感药物中的应用
[4] 云南彝族药臭灵丹药用价值研究进展