背景及概述[1]
钴胺素转运蛋白受体CD320(cluster of differentiation 320)为低密度脂蛋白受体家族成员，在钴胺素转运过程中发挥重要作用，参与机体多种生理过程的调节。有研究采用RT-PCR克隆山羊(Capra hircus)CD320基因，并对其序列进行生物信息学分析，同时采用q RT-PCR技术分析CD320在成年山羊不同组织(心、肝、脾、肺、肾、卵巢、骨骼肌、睾丸)以及睾丸发育各时期中的表达谱。结果表明，成功克隆获得山羊CD320基因，其c DNA序列全长877 bp，开放阅读框为768 bp，编码255个氨基酸，预测分子量约为27.18 k D；与其他物种同源比对及系统发生分析表明，该基因编码的蛋白在低密度脂蛋白受体A型结构域LDLRA)和跨膜域的核心位点高度保守；CD320在成年山羊各个组织中均有表达，在肺、睾丸、肌肉组织中表达水平显著高于其他组织(P<0.01)；在睾丸中，随着发育成熟，CD320的表达量持续升高，性成熟期时表达量最高(P<0.01)，在附睾中不同部位间的表达量也存在差异，整体也以6月龄(性成熟)时表达量最高。CD320分子(CD320)重组蛋白将目的基因连接在表达载体后，通过加入诱导剂IPTG诱导目的基因表达。表达载体除具有蛋白表达所需要的启动子外，在终止子前有6个His编码序列，便于CD320分子(CD320)重组蛋白蛋白的亲和层析纯化。
CD320分子(CD320)重组蛋白实验步骤[1]
1.设计CD320分子(CD320)重组蛋白的N端10-15个氨基酸的简并序列。
2.引物合成上述简并序列，同时设计合成目的基因反向引物。
3.PCR扩展目的基因，这样在目的基因的5‘端就引入了兼并序列，同时不改变氨基酸序列。
4.双酶切，插入到目标载体。
5.转化。
6.挑选多个克隆（比如100-200个）到1.5ml EP管，直接诱导表达（记得带上为改造克隆菌株的对照）。
7.SDS-PAGE检测。
8.挑选高表达的多个克隆，测序。
主要参考资料
山羊钴胺素转运蛋白受体基因CD320的克隆与表达模式