背景[1-3]
碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒(微板法)用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的碱性磷酸酯酶活性。采用PNP比色法,其检测原理是Para-nitrophenyl phosphate(pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物,在酸性条件下,以AMP为磷酸酰基的受体物质,可在碱性磷酸酶的作用下生成p-nitrophenol。在碱性条件下p-nitrophenol转变成醌式结构,呈较深的黄色,产物黄色越深,说明碱性磷酸酶活性越高,反之则酶活性越低,通过酶标仪测定400～415nm处吸光度。
利用溶液颜色的深浅变化测定物质含量的方法称比色分析法。随着测试仪器的发展，从早期的目视比色到分光光度法。分光光度法不仅可适用于可见光区，还可扩展到紫外和红外光区。物质对光的吸收是比色法和分光光度法的基础，光的吸收定律：朗伯－比尔定律则是定量测定的依据。分光光度法是借助分光光度计来测量一系列标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，然后根据被测试液的吸光度，从标准曲线上求得被测物质的浓度或含量。分光光度法与目视比色法在原理上并不完全一样。分光光度法是比较有色溶液对某一波长光的吸收情况，目视比色法则是比较透过光的强度。
碱性磷酸酶（ALP或AKP）是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有AKP1、AKP2、AKP3、AKP4、AKP5与AKP6六种同功酶。其中第1、2、6种均来自肝脏，第3种来自骨细胞，第4种产生于胎盘及癌细胞，而第5种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。
应用[4][5]
用于荧光免疫层析法快速定量检测前白蛋白和骨特异性碱性磷酸酶
前白蛋白(Prealbumin,PA)和骨特异性碱性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase,BAP)分别作为检测蛋白质-能量营养和骨钙营养状况的特异性生化指标,能够稳定并准确地监测人体的营养状况。
通过对免疫层析方法实验参数的优化,旨在建立快速定量检测人血清中PA和BAP的两种荧光免疫层析方法,并将建立的方法推广应用于临床,为人体营养状况的监测提供可靠的数据。
采用双抗夹心原理,建立了定量检测血清中PA的荧光免疫层析方法。
根据试纸条检测线(T线)和质控线(C线)的荧光强度的比值(FIT/FIC)与样本中PA浓度成正比,从而实现定量检测。实验对抗PA单克隆抗体和多克隆抗体进行了配对筛选。
通过EDC一步介导法制备荧光微球-抗PA单克隆抗体标记物,并对标记过程中以及试纸条制备中的实验参数进行了优化,选择的实验条件检测样本中PA的含量。免疫层析试纸条的检测限为1.0 ng/m L,20 min内就能得到检测结果,在8.0 ng/m L~110.0 ng/m L浓度范围内有很好的线性关系(R2=0.998);与血红蛋白、白蛋白等没有明显交叉反应,特异性较好;加标回收实验的变异系数均在10%以内,重复性良好;将本方法与免疫比浊法进行了方法学比较,结果显示两者的相关系数为0.94。实验结果说明建立的PA荧光免疫层析试纸条具有灵敏、特异、省时等特点。
参考文献
[1]Intermatrix Synthesis as a rapid,inexpensive and reproducible methodology for the in situ functionalization of nanostructured surfaces with quantum dots[J].Julio Bastos-Arrieta,Jose Mu?oz,Anja Stenbock-Fermor,Maria Mu?oz,Dmitri N.Muraviev,Francisco Céspedes,Larisa A.Tsarkova,Mireia Baeza.Applied Surface Science.2016
[2]Gold-coated carbon nanotube electrode arrays:Immunosensors for impedimetric detection of bone biomarkers[J].Madhumati Ramanathan,Mitali Patil,Rigved Epur,Yeoheung Yun,Vasselin Shanov,Mark Schulz,William R.Heineman,Moni K.Datta,Prashant N.Kumta.Biosensors and Bioelectronics.2016
[3]Anion-intercalated layered double hydroxides modified test strips for detection of heavy metal ions[J].Nan Wang,Jianchao Sun,Hai Fan,Shiyun Ai.Talanta.2016
[4]A portable chemiuminescent imaging immunoassay for simultaneous detection of different isoforms of prostate specific antigen in serum[J].Anran Liu,Fang Zhao,Yuewu Zhao,Li Shangguan,Songqin Liu.Biosensors and Bioelectronics.2016
[5]杨亚杰.荧光免疫层析法快速定量检测前白蛋白和骨特异性碱性磷酸酶[D].南昌大学,2016.