背景[1-3]
Anti-AKT1抗体是一类可以特异性结合Anti-AKT1的多克隆抗体，主要用于检测Anti-AKT1的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多种免疫学实验。
检测原理：双抗体夹心法测定标本中Anti-AKT1水平。用纯化的Anti-AKT1抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入Anti-AKT1，再与HRP标记的Anti-AKT1抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Anti-AKT1呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中Anti-AKT1浓度。
AKT/蛋白激酶B信号作用通道调控细胞增殖和生长，参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程。虽然在其他通道构成部分中也发现了激发突变的现象，而以前却不知道有激发癌症的AKT点突变。
AKT1基因编码的是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可通过磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）依赖的机制被胞外信号激活，目前发现AKT家族有三个成员，分别为AKT1/PKBα、AKT2/PKBβ和AKT3/PKBγ。
AKT则是PI3K/AKT信号通路中核心因子，PI3Ks能特异性磷酸化磷脂酰肌醇（PI）的3位羟基，产生第二信使肌醇类物质如PIP3，PIP3可促使AKT转移到细胞膜上并被PDK1/PDK2活化，活化的AKT重新定位到细胞质、细胞核或细胞内其它部位，磷酸化大量的底物蛋白，进而调节细胞的功能，异常活化的AKT会导致肿瘤发生。
应用[4][5]
用于双荧光素酶报告基因检测miR-185与AKT1靶标关系研究
在A549,NCI-H1975,NCI-H1650和LTEP-a-2四种非小细胞肺癌细胞株中mi R-185表达明显下调,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(Serine/threonine Protein Kinase 1,AKT1)表达明显升高,二者表达呈负相关关系,提示mi R-185对AKT1具有调控作用,AKT1可能是mi R-185的潜在靶基因,但不能确定二者直接相关。
为了研究mi R-185与AKT1之间靶标关系,本实验构建克隆有目的基因片段的双荧光素酶报告基因载体,利用双荧光素酶报告基因检测系统验证二者相互关系。为后续进一步探讨mi R-185和AKT1基因在肺癌发生、发展过程中可能机制提供实验基础。
方法：利用生物信息学软件,预测mi R-185调控AKT1基因结合序列,设计合成AKT13’-UTR序列及突变后AKT13’-UTR序列,将合成的两种目的基因片段,分别克隆到pmir GLO双荧光素酶报告基因载体,构建AKT13’-UTR双荧光素酶报告基因野生型载体(pmir GLO-AKT1)及其突变型载体(pmir GLO-mut-AKT1)。重组载体经PCR电泳和基因测序鉴定,以证明重组载体构建成功。
使用转染试剂lipofectamine TM 2000分别将这两种重组载体质粒与mi R-185模拟物(mimics)或mi R-185阴性对照(Negative Control,NC)共转染293T细胞,并利用双荧光素酶检测系统检测其活性。双荧光素酶报告基因载体中含有能在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶基因,一个是萤火虫荧光素酶报告基因,另一个是海肾荧光素酶报告基因。
萤火虫荧光素酶报告基因为主要报告基因,目的基因片段被克隆至萤火虫荧光素酶报告基因下游的多克隆位点上(Mμltiple cloning site,MCS)。若目的基因表达被抑制,则使萤火虫荧光素酶转录过程受阻,抑制萤火虫荧光素酶蛋白翻译,萤火虫荧光值下降,而作为标准化内参照的海肾荧光素酶的表达不受影响,此时萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性值下降,从而可以确定mi RNA与靶基因是否具有直接调控作用。
参考文献
[1]Effect of microRNA-21 on multidrug resistance reversal in A549/DDP humanlung cancer cells[J].Zuoliang Dong,Li Ren,Li Lin,Jiang Li,Yiwen Huang,Jinhong Li.Molecular Medicine Reports.2015(1)
[2]Suppression of AKT expression by mi R‐153 produced anti‐tumor activity in lung cancer[J].Ye Yuan,Weijie Du,Ying Wang,Chaoqian Xu,Jinghao Wang,Yang Zhang,Huimin Wang,Jiaming Ju,Liang Zhao,Zhiguo Wang,Yanjie Lu,Benzhi Cai,Zhenwei Pan.Int.J.Cancer.2015(6)
[3]Ezrin protein overexpression predicts the poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinomas[J].Junjie Piao,Shusen Liu,Yunjie Xu,Changan Wang,Zhenhua Lin,Yunzhi Qin,Shuangping Liu.Experimental and Molecular Pathology.2015(1)
[4]Role of microRNA-34 family in cancer with particular reference to cancer angiogenesis[J].Hamidreza Maroof,Ali Salajegheh,Robert Anthony Smith,Alfred King-Yin Lam.Experimental and Molecular Pathology.2014(2)
[5]曹大龙.双荧光素酶报告基因检测miR-185与AKT1靶标关系[D].蚌埠医学院,2015.