羊抗猪IGG-HRP的应用

2020/8/27 11:11:01

背景[1-3]

羊抗猪IGG-HRP是以猪IGG-HRP为抗原的HRP羊多克隆抗体,可以特异性结合猪IGG-HRP。羊抗猪IGG-HRP主要用于ICC/IF,Dotblot,ELISA,IHC-P,IHC-Fr,Immunomicroscopy,WB等猪IGG-HRP检测实验。

抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇(表位)和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性。这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的。除两者分子构型高度互补外,抗原表位和抗体超变区必须密切接触,才有足够的结合力。

抗原抗体反应可分为两个阶段:阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段,此阶段反应快,仅需几秒至几分钟,但不出现可见反应;

第二阶段为可见反应阶段,这一阶段抗原抗体复合物在适当温度、pH、电解质和补体影响下,出现沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合介导的肉眼可见的反应,此阶段反应慢,往往需要数分钟至数小时。

免疫球蛋白G(IgG)是在脾脏和淋巴结中合成,在人体血清中的含量最高(占Ig量的75%),而且在血清中半衰期长,主要分布在血清和组织液中,是抗细菌、抗毒素和抗病毒抗体的主要组成部分,也是机体抗感染免疫的过程中的重要物质基础。由于IgG的含量最高,是人体免疫反应的最重要的物质基础,而且它也是唯一能通过胎盘屏障的免疫球蛋白,对哺乳动物新生幼仔,新生儿抗感染起重要作用。

应用[4][5]

用于流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原域与猪IgG1-Fc片段在大肠杆菌中的融合表达及其应用研究

利用E.coli原核表达系统对JEV主要结构基因E蛋白基因和猪IgG1-Fc片段基因在大肠杆菌中进行了融合表达,并利用表达产物初步建立了检测JEV抗体的新型SPA协同凝集试验,同时免疫BALB/c小鼠,评价融合蛋白E-pFc诱导BALB/c小鼠产生抗JEV特异性免疫效果。这为新型流行性乙型脑炎的血清诊断方法的建立和新型疫苗的研制奠定了基础。

研究结果如下:1.根据GenBank公布的猪IgG1的核苷酸序列,设计一对引物,克隆猪IgG1-Fc域中包含部分CH2和完整CH3片段的基因。测序结果表明,RT-PCR产物大小为469bp,该片段的核苷酸序列与GenBank收录的猪IgG1的核苷酸序列同源性为99.2%,与猪IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4核苷酸序列同源性分别为89.7%、89.7%、96.7%以及91.4%。从遗传进化树中可以看出,扩增片段与猪IgG1的遗传距离最近,在同一分支上。这说明我扩增的序列是猪IgG1亚型的。

2.该片段编码的氨基酸序列的长度为120,与猪源IgG氨基酸序列同源性较高,为79.2%~98.3%,与其它动物IgG氨基酸序列同源性低于68.3%。从推导的氨基酸序列可以看出,该片段中含有两个半胱氨酸Cys38和Cys98,这与设计一致。

3.通过Linker连接到表达载体pET-E中E基因的下游,即构建成了重组表达质粒pET-E-pFc,用酶切鉴定插入目的基因的正确性。将其转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和超声波裂解菌体后,运用SDS-PAGE进行可溶性分析,然后以His·Bind螯合层析柱和SPA亲和层析柱两种方法纯化融合蛋白,SDS-PAGE、薄层凝胶扫描、Western Blotting和iELISA对该融合蛋白进行了鉴定,并分析了两种亲和层析方法的纯化效果。

参考文献

[1]Viral encephalitis of public health significance in India:Current status[J].Rashmi Kumar.The Indian Journal of Pediatrics.1999(1)

[2]Japanese encephalitis virus nonstructural protein NS3 has RNA binding and ATPase activities[J].Tsutomu Takegami,Daitoku Sakamuro,Toru Furukawa.Virus Genes.1995(2)

[3]A single gene controls resistance to Japanese encephalitis virus in mice[J].K.Miura,T.Onodera,A.Nishida,N.Goto,Y.Fujisaki.Archives of Virology.1990(3)

[4]Maturation process of Japanese encephalitis virus in cultured mosquito cells in vitro and mouse brain cells in vivo[J].T.Hase,P.L.Summers,K.H.Eckels,W.B.Baze.Archives of Virology.1987(3)

[5]魏建超.流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原域与猪IgG_1-Fc片段在大肠杆菌中的融合表达及其应用研究[D].南京农业大学,2006.

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