背景[1-3]
人血小板型磷酸果糖激酶(PFKP)ELISA KIT是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）。已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用产生颜色，颜色的深浅和样品中指标的浓度呈比例关系。
操作步骤：
1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。
4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。
8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9．在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于血小板亚型磷酸果糖激酶促进肾透明细胞癌代谢重编程和细胞增殖研究
肾透明细胞癌(cc RCC)在代谢上的改变包括有氧糖酵解,提高的戊糖磷酸途径活性和降低的氧化磷酸化等。
磷酸果糖激酶(PFK),糖酵解途径的关键酶,具有L、M和P亚型并在不同的组织分布。到目前为止仍然不清楚哪种亚型PFK大量表达在cc RCC中,是否在促进有氧糖酵解和大分子的生物合成,以及有支持细胞增殖的重要作用。
研究方法1.q PCR、Western blot检测肾透明细胞癌组织中PFKP、PFKM和PFKL的表达。免疫组化检测肾透明细胞癌组织中PFKP的蛋白水平。
2. q PCR、Western blot检测正常肾小管上皮细胞HK-2、肾透明细胞癌细胞系Caki-1、769-p和786-O细胞的PFKP表达。
3. si RNA干扰Caki-1、769-p和786-O细胞PFKP的表达,检测细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡。
4. si RNA干扰Caki-1、769-p和786-O细胞PFKP的表达,检测细胞葡萄糖摄取、乳酸生成、氧气消耗和PFK1酶活性。
5. 建立稳转sh PFKP的Caki-1细胞,使用LCMS检测代谢组的变化。
6. 建立稳转shp53的Caki-1细胞,探索p53在抑制PFKP诱导的细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及葡萄糖摄取、乳酸生成和氧气消耗的改变中的作用。
7.使用稳转sh PFKP的Caki-1细胞进行裸鼠成瘤实验。
参考文献
[1]EAU Guidelines on Renal Cell Carcinoma:2014 Update[J].Borje Ljungberg,Karim Bensalah,Steven Canfield,Saeed Dabestani,Fabian Hofmann,Milan Hora,Markus A.Kuczyk,Thomas Lam,Lorenzo Marconi,Axel S.Merseburger,Peter Mulders,Thomas Powles,Michael Staehler,Alessandro Volpe,Axel Bex.European Urology.2015(5)
[2]limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies[J].Matthew E.Ritchie,Belinda Phipson,Di Wu,Yifang Hu,Charity W.Law,Wei Shi,Gordon K.Smyth.Nucleic Acids Research.2015(7)
[3]Cancer statistics,2015[J].Rebecca L.Siegel,Kimberly D.Miller,Ahmedin Jemal.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2015(1)
[4]Ischemia/reperfusion-induced upregulation of TIGAR in brain is mediated by SP1 and modulated by ROS and hormones involved in glucose metabolism[J].Meiling Sun,Mei Li,Qiao Huang,Feng Han,Jin-hua Gu,Jiaming Xie,Rong Han,Zheng-Hong Qin,Zhipeng Zhou.Neurochemistry International.2014
[5]王俊.血小板亚型磷酸果糖激酶促进肾透明细胞癌代谢重编程和细胞增殖[D].上海交通大学,2016.