背景[1-3]
牛D-乳酸(D-LA)ELISA试剂盒是利用固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）的方法检测样本中D-乳酸(D-LA)的水平。
已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。
固相夹心法酶联免疫吸附示意图
操作步骤
1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。
3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9）在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于酿酒酵母产D-乳酸的代谢工程研究
用代谢工程的方法从D-乳酸脱氢酶（D-LDH）的表达优化,耐酸性的增强,菌株生长速率的提高等方面构建D-LA高产菌株。
首先,以敲除丙酮酸脱羧酶基因的TAMH菌株为宿主菌,组合表达优化筛选D-LA生产菌株。针对4个启动子,5个D-LDH,以及2个终止子的组合表达研究表明,在构建的40个菌株中,含PTEF1-E.coli D-LDH-Tsynth25表达载体的菌株TCSt,D-LA产量最高,达到5.8 g/L,光学纯度达到了99.9%。
为了提高D-LA的产量,将该基因表达簇插入到敲除Pdcl和Pdc6基因的YIP-01菌株的Ty1多拷贝位点,利用双酶偶联方法筛选高产D-LA的整合菌株。基因组重测序结果表明,得到的整合菌株YIP-pTCSt-301含有3个D-LDH拷贝。在分批补料条件下发酵,该菌株产生了35 g/L D-LA,得率为0.45 g/g,产率为0.9 g/L/h。
为了进一步提高D-LA产量和得率,敲除了消耗D-LA的相关基因Dldl和Cyb2,转运D-LA到胞内的相关基因Jen1,以及产乙醇的相关基因Adh1。得到的YIP-JCDA1菌株在分批补料条件下发酵,产生了80 g/L D-LA,得率提高到0.6 g/g,产率为1.1 g/L/h。
其次,在YIP-JCDA1菌株的基础上表达了Issatchenkia orientalis的IoGasl基因,其编码蛋白具有耐受低pH和高盐特性。得到的YIP-IJCDA1菌株在分批补料条件下发酵,D-LA达到了85.3 g/L,得率提高到0.71 g/g,产率提高到1.20 g/L/h。
参考文献
[1]Continuous production of d-lactic acid from cellobiose in cell recycle fermentation usingβ-glucosidase-displaying Escherichia coli[J].Yuji Aso,Mikikazu Tsubaki,Bui Hoang Dang Long,Ryo Murakami,Keisuke Nagata,Hirohisa Okano,Ngo Thi Phuong Dung,Hitomi Ohara.Journal of Bioscience and Bioengineering.2018
[2]Systematically redesigning and optimizing the expression of D-lactate dehydrogenase efficiently produces high-optical-purity D-lactic acid in Saccharomyces cerevisiae[J].Wei Zhong,Maohua Yang,Tingzhen Mu,Fan Wu,Xuemi Hao,Ruonan Chen,Moustafa Mohamed Sharshar,Anders Thygesen,Qinhong Wang,Jianmin Xing.Biochemical Engineering Journal.2018
[3]Direct fermentation of Jerusalem artichoke tuber powder for production of l-lactic acid and d-lactic acid by metabolically engineered Kluyveromyces marxianus[J].Jung-Hoon Bae,Hyun-Jin Kim,Mi-Jin Kim,Bong Hyun Sung,Jae-Heung Jeon,Hyun-Soon Kim,Yong-Su Jin,Dae-Hyuk Kweon,Jung-Hoon Sohn.Journal of Biotechnology.2018
[4]Enhanced d‐lactic acid production by recombinant Saccharomyces cerevisiae following optimization of the global metabolic pathway[J].Ryosuke Yamada,Kazuki Wakita,Ryosuke Mitsui,Hiroyasu Ogino.Biotechnology and Bioengineering.2017(9)
[5]钟伟.酿酒酵母产D-乳酸的代谢工程研究[D].中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所),2019.