背景[1-3]
蛋白质印迹试剂盒是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
蛋白质印迹原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
应用[4][5]
用于组成性活化DNMT1沉默miR-34a-5p对肝癌干细胞特性的影响研究
以SMMC-7721细胞系CD133+肝癌球细胞作为LCSCs模型。分别应用ELISA、蛋白质印迹、定量逆转录PCR（qRT-PCR）和甲基化特异性PCR（MSP）比较SMMC-7721细胞与LCSCs DNMT1活性以及蛋白和mRNA表达、miR-34a-5p表达及其启动子甲基化水平。
分别用球形成法、琼脂集落形成法、流式细胞术分析、蛋白质印迹法和qRT-PCR检测SMMC-7721细胞与LCSCs的肝癌球形成率、集落形成率、CD133阳性细胞百分率、CSCs标志物（CD133、CD44和ALDH1）以及多能性转录因子（Bmi1、Sox2和Oct4）蛋白和（或）mRNA表达水平;以体外评价LCSCs特性。
通过测定LCSCs裸鼠移植瘤生长速率和CD133及CD44蛋白表达,以体内评价LCSCs特性。利用地西他滨（DAC）和DNMT1 shRNA或DNMT1cDNA等抑制或过表达DNMT1基因确定DNMT1组成性活化促进LCSCs特性以及抑制DNMT1介导FVTF抑制LCSCs特性作用。
分别采用miR-34a-5p模拟物和抑制物鉴定低表达miR-34a-5p促进LCSCs特性以及上调miR-34a-5p介导FVTF抑制LCSCs特性作用。分别使用荧光素酶报告基因、FoxM1敲低或过表达、DAC或硫链丝菌素（THI）处理鉴别miR-34a-5p靶基因FoxM1和FoxM1过表达促进LCSCs特性以及FVTF通过下调FoxM1表达抑制LCSCs特性。
在拓展性研究中,MHCC97H细胞系肝癌球细胞用作肝癌干细胞样细胞（LCSLCs）;并明确DNMT1/miR-34a-5p/FoxM1信号轴在MHCC97H细胞系LCSLCs的表型和功能以及FVTF的药理作用。基于TCGA和GEO数据库肝细胞癌队列的生物信息学分析,以评价DNMT1/miR-34a-5p/FoxM1信号轴在肝细胞癌发生和肝细胞癌病人预后中的作用。
参考文献
[1]miR?34a inhibits esophageal squamous cell carcinoma progression viaregulation of FOXM1[J].Haibo Zhou,Li Yang,Xinhua Xu,Mingqian Lu,Rong Guo,Daojun Li,Qiao Huang,Yang Liu,Glenn Deng,Yalin Xu.Oncology Letters.2019(1)
[2]Cancer statistics,2019[J].Rebecca L.Siegel MPH,Kimberly D.Miller MPH,Ahmedin Jemal DVM,PhD.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2019(1)
[3]Cancer signaling pathways with a therapeutic approach:An overview in epigenetic regulations of cancer stem cells[J].Ali Akbar Samadani,Syedeh Elham Norollahi,Ali Rashidy-Pour,Fariborz Mansour-Ghanaei,Shadman Nemati,Farahnaz Joukar,Amir Mahmoud Afshar,Sahar Ghazanfari,Mahsa Safizadeh,Pooya Rostami,Magtouf Gatei.Biomedicine&Pharmacotherapy.2018
[4]Casticin inhibits the epithelial-mesenchymal transition in ovarian carcinomavia the hedgehog signaling pathway[J].Jing Zhang,Yinghong Cui,Shuwen Sun,Jianguo Cao,Xiaoling Fang.Oncology Letters.2018(4)
[5]曹晓诚.组成性活化DNMT1沉默miR-34a-5p对肝癌干细胞特性的影响[D].湖南师范大学,2019.