背景[1-3]
蛋白质转印印迹膜萘酚蓝黑(NBB)染色试剂盒主要用于对聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和硝酸纤维素膜上蛋白质的染色。
萘酚蓝黑为黑褐色粉末，可溶于水，水溶液呈蓝黑色，加入浓盐酸产生绿光蓝色沉淀；加入氢氧化钠溶液产生蓝色沉淀。溶于乙醇，呈蓝色，微溶于丙酮，不溶于其他有机溶剂。于浓硫酸中呈蓝光绿色，稀释后产生暗绿光蓝色沉淀；
于浓硝酸中呈暗绿色溶液后转变为酱红色；于10%氢氧化钠溶液中产生蓝色沉淀。染色时，遇铜离子色泽略有变化；遇铁离子色泽略带浅绿。
蛋白质转印印迹膜图
萘酚蓝黑主要用于对聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和硝酸纤维素膜上蛋白质的染色。在电泳后，推荐固定蛋白质在胶上。
胶用0.1%氨基黑10B的7%(v/v)醋酸溶液染至少2小时，然后用7%(v/v)醋酸溶液脱色。检测灵敏度大概是考马斯亮蓝R250的20%。
实验开始前完成蛋白质电泳和转印然后进行下列操作：
将6 cm X 8 cm大小的含有蛋白的印迹膜置于染色塑料盒里小心加入5毫升染色液，覆盖膜表面；
室温下，孵育5分钟，或直至条带显现，避免光照；倒掉染色液；
加入适量的无离子水清洗，直至背景清晰（注意：不要过度清洗，造成褪色）；
取出印迹膜烘干；
去色处理将染色后的印迹膜置于染色塑料盒里
加入适量的无离子水清洗，倒掉无离子水，小心加入25毫升去色液，覆盖膜表面；室温下，孵育15秒，或直至条带消失；倒掉去色液，加入适量的无离子水清洗3分钟；
继续各种后续，例如测序、免疫杂交等。
应用[4][5]
用于家蚕蚕蛹过敏原蛋白质组学和分子生物学研究
对家蚕蚕蛹的过敏原进行研究。1.家蚕蚕蛹过敏原的SDS-PAGE和免疫印迹分析:首先利用超速离心法提取家蚕蚕蛹的总蛋白,用12%的SDS-PAGE对蛋白粗提液进行分离,之后分别用11份家蚕蚕蛹过敏病人的血清与蛋白进行IgE结合测试。
结果发现:家蚕蚕蛹的蛋白有10多条蛋白质条带,其中在25kDa附近3条为主带。
在与11份患者血清的反应中,共检测到分子量近似为28、35、37、65、90kDa的阳性蛋白条带。其中28、35、37、65kDa处的蛋白条带与血清的阳性反应率达到了100%。提示家蚕蚕蛹中确实存在着特定的过敏原蛋白。
2.家蚕蚕蛹过敏原的蛋白质组学研究:实验目的是通过双向电泳、免疫印迹、质谱的方法对家蚕蚕蛹过敏原有更明确的研究。
首先用双向电泳对家蚕蚕蛹蛋白进行分离,构建较为完整的家蚕蚕蛹蛋白双向电泳图谱;接着利用免疫印迹方法,使电转印到膜上的蛋白与阳性家蚕蚕蛹过敏患者混合血清进行反应,对于能够与过敏病人血清中IgE结合的蛋白进行质谱鉴定。
实验结果显示:家蚕蚕蛹蛋白在双向电泳中被成功分离,共得到288个蛋白点。在免疫印迹实验中,共有13个蛋白点可以与家蚕蚕蛹过敏病人血清发生阳性反应,而在阴性对照中,未见其发生阳性反应;对这13个阳性点进行质谱鉴定后,发现它们分别属于6类不同的蛋白:卵黄原蛋白、30K家族蛋白、几丁质酶、丙糖磷酸盐异构酶、热休克蛋白20.8和家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂。
3.家蚕蚕蛹过敏原蛋白几丁质酶原核表达载体的构建。
参考文献
[1]Identification of vitellogenin as an allergen in Beluga caviar allergy[J].M.Perez‐Gordo,S.Sanchez‐Garcia,B.Cases,C.Pastor,F.Vivanco,J.Cuesta‐Herranz.Allergy.2008(4)
[2]Cow’s milk allergens identification by two‐dimensional immunoblotting and mass spectrometry[J].MassimoNatale,CarolinaBisson,GiovannaMonti,AmaliaPeltran,LorenzaPerono Garoffo,SabinaValentini,ClaudioFabris,EnricoBertino,AlessandraCoscia.Mol.Nutr.Food Res..2004(5)
[3]Immunotherapy of Allergic Disease[J].R.Valenta,T.Ball,M.Focke,B.Linhart,N.Mothes,V.Niederberger,S.Spitzauer,I.Swoboda,S.Vrtala,K.Westritschnig,D.Kraft.Advances in Immunology.2004
[4]Acidic mammalian chitinase–a potential target for asthma therapy[J].Louise E.Donnelly,Peter J.Barnes.Trends in Pharmacological Sciences.2004(10)
[5]刘硕.家蚕蚕蛹过敏原蛋白质组学和分子生物学研究[D].南昌大学,2010.