细菌耐药问题的日益严重，促使对新型抗菌药物的寻找日益紧迫。更多的相关机制也在临床实践和相关研究中不断获得新的突破。本期我们分享一篇十分有趣的文章，分析了抗真菌药物卡泊芬净对耐万古霉素肠球菌的杀菌活性机理。
卡泊芬净（Caspofungin）是半合成脂肽 （棘白菌素，echinocandin）化合物，能够抑制许多丝状真菌和酵母菌细胞壁的β（1,3）-D-葡聚糖的合成，从而发挥抗真菌的作用。
体外实验结果表明，卡泊芬净对屎肠球菌的生长有显著影响。研究者使用一些非抗生素分子，在有治疗作用的游离血浆浓度下，测定它们对屎肠球菌（菌株编号Aus0004）的生长动力学。
首先，测定了广泛应用于ICU患者的8种不同的非抗细菌药物，包括：去甲肾上腺素、吗啡、对乙酰氨基酚、咪达唑仑、普通肝素、泮托拉唑、阿曲库铵和卡泊芬净，对于菌株Aus0004生长情况的影响。结果显示，只有卡泊芬净对屎肠球菌的生长有显著的抑制作用，采用亚抑菌浓度（1/4 × MIC，8 mg/l）的卡泊芬净，卡泊芬净对细菌生长有显著影响，延迟时间约为1小时（图1）。
图1. 不同非抗细菌药物对屎肠球菌Aus0004生长的影响。
有趣的是，除屎肠球菌外，卡泊芬净对不同的细菌表现出了不同的抑制作用。对粪肠球菌（ATCC 29212）和金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）的生长也表现出显著的抑制作用（图2）；而对大肠埃希菌（ATCC 25922）、阴沟肠杆菌（ATCC 13047）和铜绿假单胞菌（ATCC 27853）的生长则无显著影响（图3）。
图2. 卡泊芬净对屎肠球菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌生长的影响。
图3. 卡泊芬净对大肠埃希菌、阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌生长的影响。
为了比较抗真菌药物对屎肠球菌的抗菌活性，采用肉汤微量稀释法测定了不同抗菌和抗真菌药物对屎肠球菌Aus0004的MIC。其中，卡泊芬净对屎肠球菌的活性是其他抗真菌药物（包括两性霉素B、伏立康唑和5-氟胞嘧啶）的32倍（表1）。
表1. 不同抗细菌和抗真菌药物对屎肠球菌Aus0004的体外抗菌活性（MIC）。
接下来，作者以抗革兰阳性药物为参照，测定卡泊芬净对屎肠球菌 Aus0004是否具有抑菌或杀菌活性。结果显示：培养3小时，卡泊芬净对屎肠球菌存在一种快速的杀菌效果，且杀菌活性比达托霉素更加迅速和显著。而万古霉素和利奈唑胺均无杀菌活性（图4）。
图4. 不同药物对屎肠球菌 Aus0004的杀菌活性。MHB：Mueller-Hinton broth.
使用扫描电镜和透射电镜观察了卡泊芬净（8mg/l）对细胞壁组分的影响。扫描电镜显示卡泊芬净导致细胞表面粗糙和挤压，表明卡泊芬净对细菌包膜影响很大（图5）。透射电镜没有发现卡泊芬净对细胞壁厚度的任何影响（图6）。
图5. 扫描电镜显示卡泊芬净导致细胞表面粗糙和挤压。
图6. 透射电镜没有发现卡泊芬净存在时细胞壁厚度的任何变化。
使用超高效液相色谱和串联质谱对卡泊芬净亚抑制浓度（8 mg/l）下生长的屎肠球菌的肽聚糖化学成份进行分析，结果表明：在指数中期、指数晚期和稳定早期阶段，有四种多肽含量显著降低。此外，不同种类的多肽在不同的生长时期，下降的幅度也不尽相同（20%至60%间）。这种下降与卡泊芬净对屎肠球菌肽聚糖组成的重要影响相一致。由于肽聚糖的生物合成在细胞生长过程中是必不可少的，前述所观察到的屎肠球菌的生长变化可能与卡泊芬净所引起的肽聚糖修饰有关。
接下来，研究人员采用全转录组学方法，揭示卡泊芬净对屎肠球菌Aus0004不同代谢途径的影响。结果表明，580个基因（占染色体基因的20.3%）的表达水平发生了显著变，其中上调基因321个，下调基因259个。根据 COG 和 KEGG 的分类，将两种条件下表达 mRNA 修饰量的基因分为功能类别。在这580个基因中，存在酪氨酸磷酸酶的情况下，编码碳水化合物转运或代谢、能量产生或转化相关蛋白的基因表达明显受到抑制；而编码转录、复制、重组和修复相关蛋白的基因表达明显上调；无机离子转运或代谢相关蛋白的基因表达明显上调（图7和图8）。
图7. 不同表达水平的功能基因分类。
图8. 不同代谢通路基因的表达水平。
在20个表达受到卡泊芬净高度抑制的基因中，研究人员发现13个基因参与了碳水化合物的运输或代谢下调。另有几个与甘油代谢有关的基因也表现出转录水平的下降。现在人们普遍认为甘油是合成脂质的必要前体，在许多革兰氏阳性菌中，包括肠球菌，甘油是合成脂磷壁酸的必要前体。与丙酮酸代谢有关的基因也受到了强烈的抑制，这种ATP生成的减少可以解释存在卡泊芬净时细菌适应性的变化。所有这些数据都指出，卡泊芬净的存在引起了一种重要的压力形式，这种压力改变了糖代谢和对屎肠球菌生长至关重要的交叉连接的代谢途径。
最后，研究者分析了卡泊芬净对屎肠球菌Aus0004耐药性的影响。非常有趣，存在卡泊芬净时，万古霉素的MIC增加了4倍，而达托霉素、替考拉宁和环丙沙星没有变化。这个结果对于抗感染治疗时采用病原全覆盖的策略是有一定的警示作用的，即卡泊芬净对万古霉素对肠球菌的抗菌活性是有拮抗作用的。
总之，生长实验发现卡泊芬净对屎肠球菌的体外生长有显著影响，并通过电子显微镜观察和肽聚糖成分分析证实了这一效应。后续的机制分析表明，
丙酮酸代谢相关基因的阻遏似乎对细菌细胞活力有着巨大的影响，而甘油代谢的减少可以解释肽聚糖的构象修饰。这些都有可能是非抗细菌药物对细菌病原体发挥作用的潜在机制。