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GST标签蛋白抗体的应用

发布日期:2021/12/2 11:21:10

背景[1-3]

GST标签蛋白抗体是一类可以特异性结合GST标签蛋白的多克隆抗体,主要用于体外GST标签蛋白的免疫学检测试验。

标签蛋白抗体是一类经过亲和纯化的小鼠单克隆抗体。用于检测各种商品化表达载体上的标签序列(如:MyC、His、GST、HA等),籍以分析检测目的蛋白的表达含量及其功能。其原理是抗原—抗体反应,这些标签抗体可以高度特异地结合对应的标签融合蛋白。标签抗体是开展基因蛋白表达、信号转导和基因功能研究的常用工具。

GST标签蛋白抗体免疫组化

GST标签由211个氨基酸组成,大小约为26KDa。一般利用重组DNA技术插入到目的蛋白的C末端或N末端(大肠杆菌中常用在N端),再利用相应的抗GST标签抗体进行鉴定和检测,广泛应用于重组蛋白表达以及亲和纯化实验中。

GST标签作用机理

①应用于原核表达;作为一种高度可溶的蛋白,能增加外源蛋白的可溶性,在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用。

②GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱,因此保留了蛋白的抗原性和生物活性;

③GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力,因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂(如:盐酸胍或尿素等);

④GST融合蛋白已经成为分子生物学领域的基本工具,其广泛用于研究蛋白质-DNA及蛋白质-蛋白质间的相互作用,也可作为抗原用于免疫学或疫苗的研究

GST标签蛋白纯化

通常采用亲和柱层析法,利用谷胱甘肽(GSH)的结构能够和GST的结合位点互补,再利用谷胱甘肽交换洗脱的原理对蛋白进行纯化。

①在纯化柱中,先将谷胱甘肽偶联到琼脂糖介质上(利用SH基团能与琼脂糖介质上的环氧乙烷结合);

②由于谷胱甘肽能与GST-tag发生特异性结合,样品加入纯化柱后,带有GST标签的融合蛋白被偶联在介质上的谷胱甘肽配体吸附,而其它蛋白被洗脱;

③在非变性条件下加入还原型GSH洗脱液,得到GSH-GST-Protein蛋白复合物。得到的目的蛋白需要去除GST标签,再应用于下游实验。

应用[4][5]

用于GST抗体包被免疫磁珠纳米佐剂的初步研究

利用化学共沉淀法合成磁珠,再将抗GST标签蛋白的抗体偶联到改性后的磁珠表面,从而制得表面包被GST抗体的IMB,即IMB-GSTAb,然后用IMB-GSTAb捕获GST-HA1(禽流感病毒HA1抗原)融合蛋白,最后用捕获GST-HA1的IMB免疫实验动物鸡,探索IMB-GSTAb的生物安全性和免疫增强作用。动物实验证明IMB具有一定的免疫增强作用和良好的生物安全性。

1. 抗GST标签蛋白抗体的制备培养含GST表达载体(pGEX-KG)的大肠杆菌BL21,收获GST蛋白。将经Sepharose 4B柱子纯化得到的GST蛋白免疫2周龄艾维因鸡,制备鸡抗GST多克隆抗体。ELISA检测血清效价达1.28×104,Western blot结果表明制备的抗体具有生物学活性。采用饱和硫酸铵粗提和葡聚糖凝胶(Sephadex G-200)过柱相结合的方法纯化抗体,得到了纯度较高的抗体IgG,结果显示本研究制备的鸡抗GST多抗与GST-NS1融合蛋白、GST-NP融合蛋白和GST-HA1融合蛋白均具有良好的反应性。

2. IMB-GSTAb的制备采用化学共沉淀法合成Fe3O4纳米粒子,并对其表面进行修饰,使其表面带有-NH2基团和-CHO基团,得到平均粒径在30-200 nm之间并具有超顺磁性的磁珠,修饰前后磁珠的浓度分别为15.62 mg/mL和5.40 mg/mL。将磁珠与GST抗体偶联制备IMB-GSTAb,用IMB-GSTAb捕获GST与禽流感病毒HA1的融合蛋白GST-HA1。通过控制和改变缓冲介质、溶液pH值、反应时间和温度等参数,优化磁珠偶联抗体的条件。

用紫外分光光度计测定、SDS-PAGE分析和IMB-ELISA检测等方法对磁珠偶联抗体的效果进行评价,从而获得抗体最佳偶联条件为0.01M PB(pH7.4)缓冲液,37℃振荡孵育6h;IMB的最佳封闭条件为3%脱脂奶粉,37℃封闭1h;IMB-GSTAb捕获GST-HA1的最佳反应条件为37℃,2 h;

-NH2末端IMB最大捕获量为297.2±11.7μg/mL,-CHO末端IMB最大捕获量为299.1±6.9μg/mL3.IMB佐剂效应检测用捕获GST-HA1的IMB免疫2周龄鸡(A组),同时设四个对照组,分别为IMB-GSTAb组(B)、GST-HA1抗原组(C)、禽流感灭活苗(Re-5株)组(D)和PBS组(E),每组5只,分别于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d翅下静脉采血,用血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验测定血清抗体效价。

结果显示,首免后实验组和D组抗体效价上升较快,到第3周时实验组与B、C和E组均存在显著差异(P<0.01),三周后实验组抗体效价降低,表明IMB-GSTAb具有一定的免疫增强作用,能较快的诱导机体产生相应抗体。

参考文献

[1]New Aspects of Nanocrystal Research[J].Luis M.Liz-Marzán,David J.Norris.MRS Bulletin.2012(12)

[2]Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples[J].Sergey N.Preobrazhensky,David W.Bahler.Cryobiology.2009(3)

[3]Magnetic Resonance Imaging of Liver Metastases:Experimental Comparison of Anionic and Conventional Superparamagnetic Iron Oxide Particles With a Hepatobiliary Contrast Medium During Dynamic and Uptake Phases[J].Investigative Radiology.2008(7)

[4]A solid phase fluorescent capillary immunoassay for the detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef and apple cider[J].J.Czajka,C.A.Batt.Journal of Applied Microbiology.2008(6)

[5]王建忠.GST抗体包被免疫磁珠纳米佐剂的初步研究[D].华中农业大学,2011.

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