背景[1-3]
辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗兔IGG可以在Western检测时催化ECL类试剂(如ECL、BeyoECL等)产生化学发光，可以在ELISA时催化TMB产生蓝色，也可以在IHC或Western blot检测时催化DAB产生棕色沉淀。
反应性该山羊抗兔二抗与兔IgG分子有特异性反应，与其它兔免疫球蛋白（包括IgM、IgE、IgD、IgA等）的轻链有交叉反应。该二抗与血清内非免疫球蛋白无交叉反应，但可能与其它种属的免疫球蛋白有交叉反应。
辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗兔IGG
HRP（Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）是一种分子量达44000的糖蛋白，由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合而成，通常来源于辣根植物中，是临床检验试剂中的常用酶。辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。
HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。由于其易于提取、价格相对低廉，同时性质稳定，耐热及有机溶剂的作用，与抗原或抗体偶联后，活性很少受损失，因此是迄今为止在免疫学中应用最为广泛的一种标记用酶。HRP的催化底物包括色原底物、化学发光底物等，其中最常用的色原底物有邻苯二胺（OPD）、2，2’-吖嗪-（3-乙酰苯基噻唑磺酸-6）（ABTS）、四甲基联苯胺（TMB）和4-氨基安替比林:苯酚耦联底物对等；而化学发光底物则包括Luminol/增强剂等系统。
应用[4][5]
用于氨苄青霉素残留ELISA检测方法的建立及检测条件优化研究
本研究制备了氨苄青霉素的多克隆抗体，建立了氨苄青霉素免疫检测技术。通过比较两种合成方法偶联的氨苄青霉素和BSA免疫抗原刺激机体产生抗体的亲和性和效价，比较了两种合成方法的优劣。同时，对ELISA检测条件进行了优化，建立氨苄青霉素ELISA检测技术。
结果如下：1通过两种方法——物理直接偶联和以戊二醛为连接物合成了氨苄青霉素和大分子蛋白质的免疫抗原和包被抗原并用紫外光谱扫描和红外吸收光谱扫描的方法对合成物质进行了鉴定。
2将合成的氨苄青霉素免疫抗原与等量佐剂混合后多途径多次免疫兔子，第七次免疫后心脏采血，分离获得血清，并将这些血清分成3部分进行处理：一部分直接冷冻于-20℃，一部分与等量甘油混合后保藏于-20℃冰箱，另一部分血清纯化分离IgG、冷冻干燥后保存于-20℃冰箱。
3用琼扩实验对抗血清进行分析。发现抗血清能与免疫抗原产生沉淀线，而不能与以OVA作载体蛋白的检测抗原产生沉淀线。这说明琼扩实验是一种很粗略的检测方法，能检测出血清中大量存在的载体蛋白抗体，半抗原的抗体因为量少不能在琼扩实验中产生沉淀线而被检测出来。
4对ELISA检测中所用的HRP酶标山羊抗兔IgG的使用浓度和包被抗原类型及其浓度进行确定。实验结果表明，酶标二抗的使用浓度是1600倍稀释。由于HSA和BSA有很大同源性，以其为载体蛋白的合成抗原不能作为检测抗原。同时，抗血清中存在抗桥抗体，用于检测的包被抗原和免疫抗原由两种合成方法含成，以消除抗桥抗体的影响。
56只兔子产生的抗血清的效价分别为：1号抗血清和2号抗血清的效价均是64×103，3号抗血清的效价是1×103，4号抗血清的效价是8×103，5号抗血清的效价是128×103，6号抗血清的效价是4×103。其中1、2、5号兔子产生的抗浙江大学硕士论文血清的效价都远远高于3、4、6号兔子产生的抗血清。而1、2、5号兔子都是以Agl作为免疫抗原，3、4、6号兔子的免疫抗原都是Ag4。这说明不同合成方法合成的免疫抗原有不同的免疫原性。‘对间接ELISA检测条件进行优化，包括底物溶液的组成、包被液的选择、包被时间和温度的选择、封闭液的选择、兔子抗血清的温育时间、HR卫酶标羊抗兔lgG抗体的温育时间及底物加样后温育时间，并用L二（56）正交表对后6个因素进行正交实验。
加好包被液的酶标板37℃温育2h后转入4℃冰箱温育14h包被。然后以5%甘氨酸封闭醉标板。一抗的温育时间是1 00min，二抗的温育时间是120min，加底物显色1 smin产生的阴阳性抗血清的OD月5。差值。包被液的类型对实验结果的影响，其次是封闭液的类型和底物作用时间。由于二抗的温育时间对实验的结果影响不是很主要，而且二抗温育40min和温育1 00min产生的实验结果相差很少。从节约时间和成本的角度出发，在不降低实验灵敏度的前提下，二抗的握育时间定为40min。
参考文献
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