背景[1-3]
HCC78人肺腺癌贴壁细胞系来源于一位65岁男性转移性肺腺癌患者的上皮细胞样贴壁细胞，支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。
HCC78人肺腺癌贴壁细胞系
细胞培养步骤
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640培养基；北美胎牛血清，10%；双抗1%。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
二．细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
3）细胞冻存
1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。
3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。
应用[4][5]
用于新型ALK/ROS1双靶点抑制剂ZX-29的体外抗肿瘤作用及ROS1突变耐药机制研究
通过对一系列新型ALK/ROS1双靶点抑制剂筛选,选取了抑制剂ZX-29进行深入研究。利用MTT、AO/EB染色、流式细胞术和蛋白免疫印迹技术等实验方法探讨了ZX-29对棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK）阳性的NCI-H2228细胞和SLC34A2-ROS1阳性的HCC78细胞的体外抗肿瘤作用。
结果表明ZX-29能显著抑制NCI-H2228和HCC78细胞的增殖,将细胞阻滞在G0/G1期,并促进细胞凋亡,且抗肿瘤效果显著强于二代ALK抑制剂色瑞替尼和一代ROS1抑制剂克唑替尼。ALK或ROS1激酶区突变是最常见的耐药机制,在已证实的突变中,ALK的G1202R突变和ROSI G2032R突变是目前已知的耐药性最强的突变类型。
为了探讨新型抑制剂ZX-29能否克服由于基因突变导致的细胞耐药性,利用分子克隆技术及融合PCR技术构建了EML4-ALK G1202R和CD74-ROS1 G2032R突变重组质粒,随后用脂质体法将重组质粒转染到ALK和ROSI阴性的A549细胞株中,G418筛选构建突变稳转细胞模型。MTT及蛋白免疫印迹结果证明构建的突变细胞模型对克唑替尼耐药,表明成功构建突变耐药细胞株。
随后检测了突变耐药细胞株对ZX-29的敏感性,结果表明ZX-29仍然能够有效地抑制突变耐药细胞的活性,且与ALK/ROS1未突变野生型细胞的IC50相近,表明ZX-29能够克服由基因突变导致的细胞耐药性。ALK型肺癌占NSCLC的3%-5%,而ROS1型肺癌仅占NSCLC的0.9%-1.7%左右。由于ROS1型肺癌仅占很小的比例,目前几乎没有关于ROS1的生物学功能及突变耐药机制的研究。
在成功构建CD74-ROS1和CD74-ROS1 G2032R突变高表达细胞株的基础上,针对已构建细胞模型对ROS1及其突变耐药进行了深入研究。结果发现,CD74-ROS1或CD74-ROS1 G2032R的表达能够通过增加Twist1转录因子的表达,进而诱导细胞发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）,并显著增强了细胞的迁移和侵袭能力;抑制Twist1能够逆转细胞EMT,降低细胞的迁移和侵袭能力,并增强CD74-ROS1 G2032R突变耐药细胞对克唑替尼的敏感性,促进细胞凋亡。
综上所述,ZX-29是一个新型的ALK/ROS1双靶点抑制剂,能够克服由于ALK/ROS1基因突变导致的细胞耐药性,本研究为开发ZX-29成为一个有前景的抗肿瘤药物提供了实验依据和理论基础,并为克服基因突变导致细胞耐药性提供了新的研究方向和策略。
参考文献
[1]Detection of ALK fusion transcripts in FFPE lung cancer samples by NanoString technology[J].Adriane F.Evangelista,Maicon F.Zanon,Adriana Cruvinel Carloni,Flávia E.de Paula,Mariana Andozia Morini,Maressa Ferreira-Neto,IberêCauduro Soares,Jose Elias Miziara,Pedro de Marchi,Cristovam Scapulatempo-Neto,Rui M.Reis.BMC Pulmonary Medicine.2017(1)
[2]Exploring the crizotinib resistance mechanism of NSCLC with the L1196M mutation using molecular dynamics simulation[J].Maryam Kay,Fariba Dehghanian.Journal of Molecular Modeling.2017(11)
[3]Molecular Dynamics Validation of Crizotinib Resistance to ALK Mutations（L1196M and G1269A）and Identification of Specific Inhibitors[J].Nagarajan Nagasundaram,Carlton Ranjith Wilson Alphonse,Prakash Vincent Samuel Gnana,Rajesh Kannan Rajaretinam.Journal of Cellular Biochemistry.2017(10)
[4]Therapeutic strategies and mechanisms of drug resistance in anaplastic lymphoma kinase（ALK）-rearranged lung cancer[J].Ryohei Katayama.Pharmacology and Therapeutics.2017
[5]勾文峰.新型ALK/ROS1双靶点抑制剂ZX-29的体外抗肿瘤作用及ROS1突变耐药机制研究[D].沈阳药科大学,2018.