背景[1][2][3]
产气荚膜梭菌（C.perfringens）是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成动物机体组织大面积坏死，加之此菌在体内能形成荚膜，故名产气荚膜梭菌。该菌是由英国科学家 Welchii 和 Nuttad 首先从一位死亡 8 h 后的病人体内分离得到，并以发现者 Welchii 的名字来命名。产气荚膜梭菌主要的致病因是其分泌的外毒素，目前已经分离到的外毒素有 13 种，其中 α、β、ε 和 ι 是最主要的毒素因子，根据这几种外毒素的不同，可将产气荚膜梭菌分为 A、B、C、D 和 E 等 5 个血清型。
反刍动物的气性坏疽、肠毒血症、出血性肠炎、牛羊猝死症、羔羊痢疾均是由产气荚膜梭菌引起。产气荚膜梭菌作为肠道正常菌群的一种，普遍存在于动物和人的肠道内，在正常情况下并不致病，但在动物感染大量病原菌，并且应激反应导致机体抵抗力降低时等，肠道内的产气荚膜梭菌会大量繁殖，同时会产生大量外毒素，外毒素进入血液循环引发的毒血症对机体器官组织造成损伤，并且引起动物死亡。
由该菌导致的疫病具有发病急、病程短、死亡率高等特点，药物治疗很难达到效果，因此疫苗预防是控制该病的主要手段。80 年代初，我国成功研制出产气荚膜梭菌病的单价苗和多联灭活疫苗，在预防由于产气荚膜梭菌引起的疫病方面发挥了重要作用。
但在疫苗生产过程中，毒素的产生量对培养时间、温度、接种量以及培养基质量有着较高的要求，而且传统疫苗还存在安全性不高、稳定性差等缺点，因此，开发一种能够预防多种产气荚膜梭菌感染的基因工程多价亚单位疫苗或者核酸疫苗成为产气荚膜梭菌病防控技术中迫切需要解决的问题。
基本特征[3]
产气荚膜梭菌的菌体较大，为革兰氏阳性粗短大杆菌，无鞭毛，有芽孢，有荚膜。该菌厌氧不严格，芽孢呈椭圆形，位于次级端。菌落直径 2～5 mm，血琼脂平板上有溶血圈，糖发酵能力强，能产酸产气。在牛乳培养基中呈暴烈发酵现象是本菌的特征之一。产气荚膜梭菌能够产生 α、β、ε、ι、γ、η、θ、κ、λ、μ、ν 等 12 种外毒素，产生的外毒素能够损伤细胞膜、血管内皮细胞并使糖类分解，发生细胞坏死、组织水肿、充气等病变。
菌株可产生肠毒素，能引起食物中毒，细菌 DNA 中的 G+C 分子含量为 24%～27%。该菌广泛存在于土壤、人和动物的肠道以及 动物和人类的粪便中，会散发臭味，动物机体常因深部创伤而感染。此外，产气荚膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犊、仔猪、家兔、雏鸡等的坏死性肠炎等。
发病机制[3]
产气荚膜梭菌的致病条件与肉毒梭菌和破伤风梭菌相似。虽然产气荚膜梭菌产生的毒素的毒性不如肉毒梭菌和破伤风梭菌产生的毒素强，但是由于产生毒素的种类多，以及具有卵磷脂酶、纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶和 DNA 酶等多种对细胞有毒性作用的酶，使产气荚 膜梭菌具有很强的侵袭力。根据细菌产生 α、β、ε 和 ι 等外毒素的种类差别，可将产气荚膜梭菌分成 A、B、C、 D、E 五个型。
A 型菌主要产生 α 外毒素，能引起动物的坏死性肠炎、肠毒血症，B 型菌产生的毒素主要为 α、β、ε 三种外毒素，可引起羔羊痢疾、山羊、绵羊及马属动物的肠毒血症，C 型菌主要产生 α、β 两种外毒素，能引起人和家畜坏死性肠炎、反刍类动物的肠毒血症、羊猝狙等，D 型菌主要产生 α、ε 两种外毒素，可以引起反刍动物的肠毒血症，E 型菌主要引发动物的肠炎。
毒素基因[3]
1. α 毒素基因（plc）
α 毒素是产气荚膜梭菌所有毒素基因中最重要的一 种外毒素，A、B、C、D、E 等 5 个型的细菌均可产生该毒素。编码α毒素的基因 plc 位于染色体上，大小为1 194 bp， 可以编码 398 个氨基酸，分子量为 42.5 Ku，其中成熟肽 和信号肽分别由 370 个氨基酸和 28 个氨基酸组成。目前国内外学者对 α 毒素基因的功能及其致病机理研究较多。
研究发现，卵磷脂酶 C 是该毒素的主要致病因子，它是一种依赖于锌离子的多功能性金属酶，具有鞘磷脂酶和磷脂酶 C 两种因子的活性，因此，α 毒素能同时水解磷脂酰胆碱和鞘磷脂这两种组成细胞膜的固有成分。α 毒素的致病机理就是依靠这两种酶活性，将 细胞膜的膜磷脂进行水解，从而破坏细胞膜结构，导致细胞快速裂解死亡。
α 毒素具有“热 - 冷”溶解现象，当把 α 毒素加热至 70℃左右时，可以使毒素的溶血活性丧失，100℃时，其部分活性又可恢复。α 毒素的活性可以被 EDTA 和乙醚偶联的磷脂酰胆碱抑制。此外，α 毒素对胰 酶敏感，接触后容易丧失活性。α 毒素基因相对保守，虽然不同菌株之间有 1.3%的核苷酸以及 1.2%的氨基酸序 列不同，但这些核苷酸与编码氨基酸的不同并不影响 α 毒素本身的活性。
此外，各梭菌产生的 α 毒素均有一定 的同源性，具有相同的特异性。α 毒素基因的启动子能被大肠杆菌的 RNA 聚合酶所识别，因而 α 毒素在自身启动子下不仅可在产气荚膜梭菌本身中高效表达，也可在 大肠杆菌中得到高效表达。近几年来，对 α 毒素基因组中同毒素相关的氨基酸的研究取得了一定的进展，研究 发现，α 毒素中第 68 位上的组氨酸残基对毒素活性至关重要，若其残基被其它氨基酸残基取代，即可丧失其全部的活性与毒性。
2. β 毒素基因（cpb）
β 毒素可分为 β1 和 β2 毒素两种类型，两者同源性 并不高。编码 β1 毒素的 cpb 1 基因位于质粒上，与葡萄球菌的 γ 毒素有 30%核苷酸同源，分子量为 34.5 Ku。β1 毒素是一种穿孔毒素，可以损伤多种宿主细胞的细胞膜（如肠上皮细胞、内皮细胞等）。
此外，通过影响钙离子在 神经细胞膜内的分布，β1 毒素可以影响神经组织的功能，破坏正常的神经传导。该毒素对于胰酶的蛋白水解活性高度敏感，接触后容易失活。β2 毒素是一种新近报 道的毒素。目前发现从患有坏死性肠炎、小肠结肠炎的牛羊及腹泻犬的肠内容物分离到的产气荚膜梭菌均可以产生 β2 毒素。编码该毒素的基因 cpb 2 位于质粒，分子量为 28. 5 Ku。研究发现该毒素具有细胞毒性。
3. ε 毒素基因（etx）
ε 毒素仅见于 B 型和 D 型产气荚膜梭菌中，是牛羊 产气荚膜梭菌疾病的主要致病因子。编码 ε 毒素的基因 etx 位于质粒上，大小为 987 bp，分子量为 32.7 Ku。ε 毒素 基因所翻译的蛋白前体在分泌初期并不表现毒性，蛋白合成后通过蛋白酶去除毒素前体 N 端的 13 个氨基酸和 C 端 22 个氨基酸后成为有毒性的成熟肽。ε 毒素能够作用于真核细胞膜上的胆固醇和鞘脂，具有明显的细胞毒作用。
ε 毒素对不同细胞的敏感性不同，研究发现，ε 毒素 MDCK 和 G402 细胞特别敏感。ε 毒素是一种通透酶，能够造成动物上皮细胞和内皮细胞的通透性增加，导致毒素渗入机体器官，同时该毒素还能通过影响细胞骨架的功能而发挥毒性作用。研究发现，C 末端氨基酸残 基是毒素蛋白活性的关键，不同酶切产生的 N、C 末端氨 基酸残基，产生的毒素蛋白的毒性也不相同。其中蛋白经过胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶切后毒素的毒力最强。
近几年来，国内外学者对 ε 毒素研究较多，研究发现，ε 毒素能够与大鼠突触小体上的受体结合形成七聚体复合物，该复合物能够导致细胞膜通透性改变，使得大量的钾离子外溢，从而细胞内的钠离子和氯离子浓度快速升高，有害物质快速进入机体细胞，导致细胞毒性甚至 发生细胞死亡或者凋亡。此外，对 ε 毒素基因组中关键性毒素基因研究发现，将毒素蛋白序列中的唯一组氨酸定向突变为色氨酸残基后，可导致毒素对小鼠失去毒性。
4. ι 毒素基因（itx）
ι 毒素主要由 E 型产气荚膜梭菌产生。ι 毒素是一种 二元毒素，编码基因 Iap 和 Ibp 全部位于质粒上，分子量为 47.5 Ku。ι 毒素由一个靶细胞结合部分（Ib）和一个酶 激活部分（Ia）两个亚单位组成，其中 Ia 是毒性基因，Ib 是结合基因。Ia 毒素蛋白与肉毒梭菌的 C2 毒素作用类似，是一个 ADP-核糖基化毒素，可以造成宿主细胞内肌动蛋白的核糖基化，从而造成细胞骨架的破坏和感染细胞的死亡。
目前对 ι 毒素蛋白的研究较少，毒素作用 机制还不清楚。有研究认为，毒素与细胞表面的特异性受体结合后，Ib 基因编码的蛋白在细胞膜表面形成一个孔道后，Ia 基因编码的蛋白进入细胞，进而发挥毒性作用。
5. 其他毒素基因
产气荚膜梭菌除了以上 5 种主要的毒素之外，还可分泌一些其它的毒素，如 θ 毒素、肠毒素、κ 毒素、μ 毒素和唾液酸酶等。产气荚膜梭菌形成芽孢时通常会形成并 且释放肠毒素。肠毒素是一条单链的多肽，分子量为 35 Ku。编码肠毒素的基因 cpe 可同时位于质粒上，也可位于染色体上。肠毒素的氨基端发挥细胞毒性作用，羧基端与 细胞膜上的受体结合有关。
θ 毒素是一种胆固醇结合溶细胞素，也叫做产气荚膜梭菌溶血素，该毒素对氧较为敏感，各型产气荚膜梭菌均能产生 θ 毒素。编码 θ 毒素为pfo A 基因，该基因位于染色体上。pfo A 基因编码的蛋 白质共有 527 个氨基酸，其中信号肽为 27 个氨基酸组成，成熟肽为 500 个氨基酸组成。θ 毒素能够结合在细胞膜上，并在膜表面形成一个小孔，造成细胞穿孔死亡。
κ 毒素是由产气荚膜梭菌 col A 基因编码的一种胶原酶前体，去除信号肽后成为胶原酶，除了信号肽序列外，在信号肽序列中还发现了一个胶原酶的底物序列，由此推测该蛋白前体的活化方式可能是自我催化激活。μ 毒素是一种透明质酸酶，它的作用是有助于菌体细胞在组织中的扩散。唾液酸酶主要作用于真核细胞壁上糖复合物的唾液酸残基，可以造成细胞间基质的破坏。
疫苗研究
传统疫苗主要有单价疫苗、灭活疫苗和多联疫苗。单价疫苗是利用同一致病微生物的单一血清型菌、毒株的增殖培养物制备的疫苗。目前我国已经研制出肠毒血症 和羔羊痢疾等单价疫苗。不同微生物或其代谢产物组成的疫苗称为联合疫苗或联苗。近些年来国外的疫苗生产厂商相继研究出了产气荚膜梭菌的四联、五联、七联和八联苗，这些联苗不仅把各种亚型的梭菌苗联合起来进行防疫，而且还把梭菌苗与沙门氏杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌等菌苗联合起来，甚至可以与病毒苗联合起来进行防疫。
目前我国已经有了羊黑疫、快疫二联苗，羊猝狙、羊快疫二联苗，快疫、羔羊痢疾、肠毒血症三联苗。近几年我国还研制出了羔羊痢疾、羊快疫、肠毒血症、羊猝狙、羊黑疫五联苗，并取得一定预防疾病的效果。传统疫苗 在治疗和预防反刍动物因产气荚膜梭菌感染而引起的疾病方面虽然取得了一定的成果，但是这些疫苗在临床使用过程中仍然暴露了一些不足，例如单价苗难以抑制各种亚型细菌的混合感染，多联苗免疫易引起动物的副反应等。
主要参考资料
[1] 刘威, 李玉娟, 刘晓梁, 等. 产气荚膜梭菌促进黑腹果蝇的生长和发育[J]. 昆虫学报, 2016, 59(5): 530-537.
[2] 邓志爱, 李孝权, 李钏华, 等. 食品中产气荚膜梭菌的分离鉴定与基因分型[J]. 热带医学杂志, 2006, 6(6): 682-684.
[3] 孙雨, 王晓英, 董浩, 等. 产气荚膜梭菌外毒素基因与相关疫苗的研究进展[J]. 中国草食动物科学, 2016 (2): 58-62.