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赖氨酸检测方法汇总

发布日期:2018/12/20 9:57:27

赖氨酸是世界上仅次于谷氨酸的第二大氨基酸品种,目前主要应用于饲料添加剂、食品添加剂和医药中间体。赖氨酸是人体必需而又无法自身合成的第一限制性氨基酸,有 “第一缺乏氨基酸 ” 之称 , 是海洋降压药 “藻白金 ” 的主要合成原料。赖氨酸在维持体内酸碱平衡,合成核蛋白、血红蛋白 、促进大脑神经细胞的再生、参与脂肪代谢、提高机体抵抗力、保持人体氮平衡等生理活动中发挥着重要作用。 随着科技的发展,赖氨酸品种已经发展出赖氨酸盐酸盐、蛋白赖氨酸和液体赖氨酸等 。

目前常用的赖氨酸检测方法主要有甲醛滴定法 、高效液相色谱(HPLC)、化学法(茚三酮)法和西尔曼科技酶电极法。 

一、滴定法

1.原理:供试品加醋酸汞试液使溶解后,再加入冰醋酸,赖氨酸上的两个氨基与高氯酸反应,按照电位滴定法,用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定,记录高氯酸滴定液的使用量,计算,即得。

2.步骤:  

精密称取供试品80mg,加醋酸汞试液5mL使溶解后,加冰醋酸25mL,照电位滴定法,用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定,并将滴定的结果用空白试验校正,记录消耗高氯酸滴定液的体积数(mL),每1mL高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于9.133mg的盐酸赖氨酸(C6H14N2O2·HCl ),即得。

注1:“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一,“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。

二、HPLC

1.原理:采用邻苯二醛(OPA)衍生化,采用高效液相色谱-紫外检测法对衍生物进行检测

2.步骤:

(1)样品的配制 :量取赖氨酸盐酸盐注射液适量(应使所得测定液的浓度在 400 ~ 500 μg/mL 范围内),用与上述相同的 70 %乙醇稀释至刻度,混匀;

(2)样品的衍生:量取 0.15 %OPA 溶液 2 mL 置于具塞玻璃反应管内 ,加 0.5 mL 按上述方法配制的测定液, 密塞后混匀管内液体 , 将反应管置于沸水浴中加热1 min ,取出后立即冷却至室温 ,进样 10 μL 至液相色谱仪中,在326 nm下检测。   

三、茚三酮法

1.原理:赖氨酸和茚三酮在弱酸性条件下共热可以生成紫红色物质 , 且其颜色随赖氨酸浓度的变化而改变。  

2.步骤

(1.)制作标准曲线  配制不同浓度的赖氨酸溶液 , 加入 1.0mLpH为 6.0 的醋酸盐缓冲溶液和 1.0mL茚三酮试剂 ,水浴加热 15min, 冷却 10min后定容, 在 570nm处测定其吸光度 , 浓度和吸光度关系曲线。 

(2)准确量取 2.0mL赖氨酸溶液, 加入一定量的缓冲溶液和茚三酮试剂, 水浴加热, 冷却后定容至 25mL, 在 570nm处测定其吸光度。

四、酶电极法

1.原理:主要是通过赖氨酸在特异的氧化酶催化下发生氧化还原反应,其电子产物在生物传感器电极表面形成电流从而进行测定。 

2. 步骤:(1)样品的前处理:根据检测目的选择是否水解样品,将试样溶于水,做一定稀释最终样品赖氨酸浓度控制在0—200mg/ml

(2)样品的检测:将样品放入样品盘,选择样品编号,设置检测次数,点击测试,20秒检测完成后自动打印检测结果。

五、总结

高氯酸定法测定根据滴定终点时高氯酸的消耗量来计算赖氨酸浓度误差较大。茚三酮方法基本原理为:氨基酸与水合茚三酮共同加热后可发生氧化脱氨反应,生成 NH3 与酮酸 ;加热过程中酮酸裂解,放出 CO2,自身变为少一个碳的醛,水合茚三酮变为还原型茚三酮。NH3 与水合茚三酮及还原茚三酮脱水缩合,生成蓝紫色化合物。传统的茚三酮检测方法无法排除杂质氨基酸的干扰且反应过程中易受 pH 和温度变化的影响,造成测定结果准确性降低。HPLC 方法采用 2,4-二硝基氟苯(DNFB)、1-氟-2,4-二硝基苯基 -5-L-丙氨酰胺(FDAA)等衍生化试剂,虽然能够精确区分和测定D-/L-型赖基酸的含量,但对仪器精密度和操作人员要求极高,并且易受样品中杂质成分的干扰,完成一个全分析费时 25min,赖氨酸衍生物的流出时间为 14 min,费时费力费钱!酶电极法利用酶的催化反应,具有反应快速、专一性强等特点,利用酶的固定化可以重复利用酶耗材,达到低成本、快速检测的目的。    

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